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Jul 10, 2023

Desarrollo de un jurel con menos

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3190 (2023) Cite este artículo 859 Accesos 1 Citas 10 Detalles de Altmetric Metrics La edición del genoma es una tecnología que puede acelerar notablemente el cultivo y

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3190 (2023) Citar este artículo

859 Accesos

1 Citas

10 altmétrico

Detalles de métricas

La edición del genoma es una tecnología que puede acelerar notablemente la cría de cultivos y animales mediante la inducción artificial de los rasgos deseados con gran precisión. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar una variedad de caballa con agresión reducida utilizando un sistema experimental que permita la recolección eficiente de huevos y la edición del genoma. La maduración sexual y el control de la temporada y el tiempo de desove se facilitaron tecnológicamente mediante el control del fotoperíodo y la temperatura del agua del tanque de cría. Además, se examinaron en detalle las condiciones apropiadas del tratamiento a baja temperatura para retrasar la escisión, la forma del capilar de vidrio y el lugar de la inyección para desarrollar un sistema de microinyección eficiente y robusto para el estudio. Se desarrolló una cepa knockout (KO) del receptor de arginina vasotocina V1a2 (V1a2) de caballa para reducir la frecuencia del comportamiento caníbal en la etapa de alevines. El análisis de datos de video utilizando informática de bioimagen cuantificó la frecuencia del comportamiento agresivo, lo que indica una reducción significativa del 46% (P = 0,0229) en la frecuencia del comportamiento caníbal en comparación con el tipo salvaje. Además, en la cepa V1a2 KO, la frecuencia de colisiones con la pared y el consumo de oxígeno también disminuyeron. En general, el fenotipo manejable y tranquilo reportado aquí puede contribuir potencialmente al desarrollo de un producto marino estable y sustentable.

La población mundial ya ha superado los 7 mil millones y se estima que alcanzará los 9,8 mil millones en 20501. Debido a este rápido crecimiento demográfico, el consumo per cápita de proteína animal ha aumentado a escala global. Para 2030, es posible que el suministro de proteínas no pueda satisfacer la demanda, lo que provocará una "crisis de proteínas" alimentaria. En lo que respecta especialmente a los productos acuícolas, la competencia por su adquisición ha sido predominante en todo el mundo, debido al crecimiento económico en los países emergentes y al rápido aumento de la demanda de pescados y mariscos entre la población preocupada por su salud en Europa y Estados Unidos. En tales circunstancias, la producción mundial de la pesca de captura se ha mantenido estable en alrededor de 90 millones de toneladas desde la década de 1990 y casi ha alcanzado su límite2. Sin embargo, la producción acuícola sigue aumentando y, en 2014, la de pescados y mariscos comestibles superó la captura de fuentes naturales2. Por lo tanto, se espera que la industria de la acuicultura continúe expandiéndose dramáticamente como una industria en crecimiento en el suministro de proteínas y contribuya significativamente al suministro sostenible de alimentos en el mundo. Para un mayor desarrollo de la industria acuícola, sería necesario criar peces, mejorarlos genéticamente y producir variedades con características que sean convenientes para la producción acuícola y se adapten a los gustos de los consumidores.

Para la cría de peces comestibles, se han desarrollado cepas de dorada (Pagrus major) de rápido crecimiento mediante cría selectiva3. La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)4 y el lenguado (Paralichthys olivaceus)5, con rasgos de resistencia a enfermedades, se han desarrollado mediante cría selectiva utilizando marcadores genéticos. Sin embargo, la producción de nuevas razas requiere una enorme cantidad de tiempo, además de una instalación de cría específica para un tipo de pez, además de una gran cantidad de mano de obra y fondos; por lo tanto, la cría de peces se ha retrasado significativamente en comparación con la del ganado. La tecnología de edición del genoma, que se ha introducido recientemente en aplicaciones prácticas, ha atraído la atención mundial por su capacidad para inducir artificialmente el rasgo deseado con gran precisión y acelerar notablemente el mejoramiento. La edición del genoma ya se ha aplicado a la cría de peces comestibles, como la carpa común (Cyprinus carpio)6, el bagre de canal (Ictalurus punctatus)7 y la dorada8, con un aumento de la masa muscular que surge de la edición del gen de la miostatina que regula el músculo. desarrollo.

La caballa (Scomber japonicus) es un pez marino del orden Perciformes que habita en regiones templadas y subtropicales del mundo y es una especie de pez importante en Japón. En los últimos años se ha iniciado la acuicultura de esta especie en varias zonas de Japón para lograr un suministro estable que no se vea afectado por la captura de la naturaleza; Habíamos establecido un sistema de acuicultura de ciclo de vida completo por primera vez en 2012. Además de ser una especie prometedora para la acuicultura, la caballa es miembro del orden Scombridae que incluye muchas especies de peces importantes, como el atún rojo (Thunnus orientalis). , atún de aleta amarilla (Thunnus albacares) y caballa japonesa (Scomberomorus niphonius); por lo tanto, los hallazgos obtenidos de la investigación sobre esta especie pueden eventualmente ser aplicables a muchas especies. Además, tiene características útiles para ser una especie modelo de peces marinos de piscifactoría, como la maduración en un año, a diferencia de otras especies de peces marinos que tardan varios años en madurar. Por otro lado, un problema con la acuicultura de ciclo de vida completo de la caballa es la baja tasa de supervivencia de los alevines. Se sabe que los peces Scombridae, incluido el atún rojo, muestran un comportamiento agresivo e incluso canibalismo en la etapa de alevines9, y en la caballa, la eficiencia de producción es significativamente baja debido al comportamiento caníbal de los alevines. Los alevines de caballa se vuelven intensamente caníbales aproximadamente 14 días después de la eclosión, y con las técnicas de reproducción habituales, sólo aproximadamente el 10% sobrevive inmediatamente después de la eclosión hasta que crecen hasta una longitud corporal de aproximadamente 10 cm. Si se puede mejorar la tasa de supervivencia suprimiendo el canibalismo, sería una gran ventaja para los productores, contribuyendo así a la mejora de la productividad y la realización de un sistema de acuicultura sostenible.

Los neuropéptidos arginina vasotocina (AVT) y arginina vasopresina son moduladores clave de la afiliación y la agresión, respectivamente, en vertebrados mamíferos y no mamíferos10. Por ejemplo, la damisela tropical (Stegastes leucostictus) tiende a tener una agresividad significativamente mayor contra los intrusos en el territorio en el grupo inyectado con AVT en comparación con el grupo de control11. De manera similar, se ha informado que la administración de AVT mejora el comportamiento agresivo en los saltadores del barro (Periophthalmus modestus)12. Los teleósteos tienen cuatro receptores AVT (V1a1, V1a2, V2a y V2b)13. En un estudio realizado con napoleón (Thalassoma bifasciatum), se informó que la administración de un antagonista del receptor de tipo V1a reducía significativamente la agresión14. En particular, estudios recientes que utilizan tecnología de edición del genoma han informado que el comportamiento de protección de la pareja, incluida la agresión, se reduce significativamente en medaka (Oryzias latipes) con receptores V1a2 desactivados15.

El estudio actual tuvo como objetivo desarrollar una variedad de caballa manejable y fácil de criar con un comportamiento caníbal reducido durante el período de alevines utilizando tecnología de edición del genoma. Para realizar la edición del genoma y la recolección eficiente de óvulos, sería necesario construir un sistema con alta reproducibilidad que utilice el método de microinyección estable. Por lo tanto, primero desarrollamos una plataforma para la edición del genoma en caballa, seguida del desarrollo de una línea knockout V1a2; la frecuencia de agresión contra otros peces se cuantificó mediante análisis de datos de películas utilizando informática de bioimagen, y el rasgo se evaluó comparándolo con el del tipo salvaje.

Se administró por vía intramuscular un análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHa) a 15 mujeres y 20 hombres, como se informó en estudios anteriores16. La caballa desova activamente entre las 21.00 y las 01.00 h, y la ventana de fertilización para los huevos ovulados de la caballa dura sólo unas pocas horas17. El desove se controló cada 30 minutos y la mayoría de los huevos fertilizados recuperados estaban en la etapa de 1 célula. La cantidad de huevos puestos varió de un día a otro, y pudimos obtener más de 20.000 huevos fertilizados como máximo en una noche, y al menos aproximadamente 1.000 huevos fertilizados se pudieron asegurar cada noche (Fig. 1a). La cantidad de desove fue alta en la primera mitad del período de monitoreo y disminuyó en la segunda mitad (Fig. 1a). La temperatura del agua durante el monitoreo osciló entre 17,7 y 21,2 °C.

Sistema de recogida de huevos fecundados de caballa. (a) Resultados de la recolección de huevos fertilizados durante la temporada de desove natural de 2015. La columna azul muestra la cantidad de huevos fertilizados recolectados cada día. El gráfico de barras muestra la fluctuación de la temperatura del agua del mar durante el período. b) Condiciones ambientales para la maduración artificial. (c) Sección de ovario de mujeres maduradas artificialmente mediante control ambiental (arriba) y resultados de bioensayos in vitro con adición de gonadotropina coriónica humana (abajo). Las muestras de ovario se fijaron en solución de Bouin durante la noche, se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol (hasta 100%), se incluyeron en parafina, se seccionaron a 6 μm utilizando un microtomo HM 355S (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), se tiñeron con hematoxilina y contratinción con eosina. Los trozos de ovario triturados se transfirieron a medio L15 (Thermo Fisher Scientific) que contenía 100 UI de gonadotropina coriónica humana (ASKA Pharmaceutical, Tokio, Japón) y se cultivaron a 18,5 °C durante 24 h. Las flechas rojas indican huevos con descomposición de la vesícula germinal. (d) La cantidad de huevos fertilizados recolectados cuando se indujo el desove en el invierno de 2016. La recolección temprana de huevos se realizó ajustando el ambiente. (e) Tiempo de desove de la caballa bajo fotoperíodo día-noche natural (barra superior) o invertido artificialmente (barra inferior). Las barras negras y amarillas representan el día y la noche, respectivamente. (f) Hora en la que se obtuvo el óvulo fertilizado, con el día y la noche del tanque de desove invertidos.

A continuación, ampliamos el período de desove. La caballa es un pez que se reproduce estacionalmente, y en el Mar de China Oriental, cerca de la isla Kyushu, se producen múltiples desoves desde la primavera hasta principios del verano, cuando la temperatura del agua de mar está en el rango de 16 a 22 °C18. Por lo tanto, intentamos cambiar la temporada de desove ajustando el medio ambiente. A mediados del invierno, se criaron peces progenitores de caballa sexualmente inmaduros en un tanque de ambiente ajustable, se colocaron en un fotoperíodo de día largo con un período de 14 h de luz y 10 h de oscuridad, y la temperatura del agua se calentó hasta el punto de desove. temperatura de la temporada (Fig. 1b, detalles descritos en la sección "Métodos"). Se encontró que más del 80% de las hembras poseían huevos con vitelogénesis completa a principios de febrero, cuando la temperatura del agua normalmente sería la más baja del año (Fig. 1c, arriba). La descomposición de las vesículas germinales se indujo en los óvulos en un bioensayo in vitro con la adición de gonadotropina coriónica humana, lo que indica que tienen potencial de maduración final de los ovocitos (Fig. 1c inferior). Después de administrar GnRHa a 14 hembras y 16 machos madurados artificialmente el 20 de febrero de 2016, se confirmó el desove al día siguiente (Fig. 1d). Los óvulos fertilizados se obtuvieron diariamente durante los 11 días de seguimiento (Fig. 1d).

Dado que la recolección temprana de huevos utilizó un tanque rodeado por una cortina opaca para controlar el medio ambiente, intentamos cambiar el ritmo circadiano de la caballa invirtiendo el ciclo de luz-oscuridad del entorno natural (Fig. 1e). Después de una semana de inversión del fotoperíodo, se pudieron obtener huevos fertilizados durante el día desde el primer día de desove, lo que implica una inversión exitosa del tiempo de desove original (Fig. 1f). El desove se concentró entre 2 y 3 h después de que se apagaron las luces, lo que probablemente correspondió a las 2100 y 2200 h de la tarde en el momento normal de desove (Fig. 1f).

Los huevos de caballa fertilizados comenzaron la división celular (escisión) aproximadamente 50 a 60 minutos después de la fertilización y luego se dividieron cada 10 a 15 minutos (Fig. 2a). Retrasar la escisión sería esencial, ya que a menudo se descubre que comenzó en el momento en que los óvulos fertilizados fueron recolectados y trasladados al laboratorio para prepararlos para la inyección. Los huevos fertilizados recolectados se transfirieron a placas de Petri llenas de agua de mar a varias temperaturas, desde 18 °C (temperatura natural del agua) hasta 4 °C. Se recogieron aleatoriamente aproximadamente 30 huevos cada 10 minutos entre 20 y 50 minutos a cada temperatura y se examinaron microscópicamente para determinar la proporción de huevos en las etapas de 1, 2 y 4 células. En cada momento, cuanto menor era la temperatura del agua, mayor era la proporción de huevos en etapa de 1 célula (Fig. 2b). Sin embargo, en los huevos incubados a la temperatura natural del agua, la proporción de huevos en etapa de 1 célula con respecto a todos los huevos controlados fue aproximadamente del 30% después de 20 minutos y menos del 10% después de 50 minutos (Fig. 2b). La proporción de huevos que se desarrollaron después de la etapa de 4 células aumentó a medida que aumentó la temperatura del agua y, a la temperatura natural del agua, fue del 40% después de 30 minutos y del 70% o más después de 50 minutos (Fig. 2b). El porcentaje de huevos en etapa de 1 célula después de 50 minutos fue significativamente mayor en los huevos incubados en agua de mar por debajo de 9 ° C en comparación con los incubados a temperatura natural del agua (Fig. 2c). Después de 50 minutos de recolección de huevos, en agua de mar a 9 °C, aproximadamente el 70 % de los huevos permanecieron en la etapa de 1 célula, mientras que a 4 °C y 6 °C, más del 90 % de los huevos permanecieron en la etapa de 1 célula. (Figura 2c). No hubo diferencias significativas en el porcentaje de huevos en etapa de 1 célula en las tres temperaturas (4, 6 y 9 ° C; Fig. 2c). Los huevos incubados durante 50 minutos a cada temperatura finalmente se devolvieron a la temperatura natural del agua de 18 °C y se examinó la incubabilidad normal. En los grupos de incubación a 18 °C y 9 °C, la tasa de eclosión normal fue de aproximadamente el 60 % y no hubo diferencias entre las diferentes temperaturas. Por otro lado, los huevos incubados en agua de mar a 4 °C y 6 °C apenas eclosionaron y dejaron de desarrollarse a mitad de camino (Fig. 2c). Por lo tanto, cuando los huevos se incubaron a una temperatura baja de 6 °C o menos, el desarrollo se detuvo en lugar de retrasarse. Al almacenar los huevos recolectados en agua de mar a 9 °C, se podría retrasar la división sin afectar significativamente la tasa normal de eclosión. A continuación, investigamos el tiempo de almacenamiento de los huevos recolectados en agua de mar a 9 °C. Después de la recolección, los huevos fertilizados se transfirieron inmediatamente a agua de mar a 9 °C, se incubaron durante 50 a 120 minutos, se trasladaron a la temperatura normal del agua de 18 °C y se examinaron para determinar su tasa de eclosión. Cuando se sembraron en agua de mar a 9 °C durante 60 minutos o más, la tasa de eclosión normal se redujo significativamente en comparación con la de los huevos a la temperatura natural del agua (Fig. 2e). Cuando los huevos se almacenaron durante 120 minutos en agua de mar a 9 °C, apenas eclosionaron, incluso cuando la temperatura del agua volvió a la normalidad (Fig. 2e). Por lo tanto, se consideró que el tiempo durante el cual se podían almacenar en agua de mar a 9 °C para retrasar la escisión era de 60 min como máximo. El porcentaje de huevos en etapa de 1 célula cuando se incubaron en agua de mar a 9 °C durante 50 minutos fue cercano al 70%, y dado que la inyección podía continuar mientras se regresaba gradualmente a la temperatura natural del agua, el tiempo normal de inyección podía extenderse hasta dos o tres veces.

Microinyección en embriones de caballa. (a) Escisión de huevos fertilizados de caballa. (b) Porcentaje de huevos en etapa de 1 célula en cada momento (izquierda) y porcentaje de huevos que alcanzaron la etapa de 4 células o posterior (derecha) cuando los huevos fertilizados recolectados se incubaron en agua de mar a varias temperaturas (n = 3). (c) Porcentaje de huevos en etapa de 1 célula cuando los huevos fertilizados recolectados se colocaron en agua de mar a varias temperaturas durante 50 minutos. Letras diferentes encima de las barras representan diferencias significativas (P <0,05) en los datos entre varias temperaturas de incubación. (d) Tasa de eclosión normal, cuando los huevos fertilizados recolectados se colocaron en agua de mar a varias temperaturas durante 50 minutos y luego se regresaron a la temperatura natural del agua de mar de 18 °C para la incubación. Letras diferentes encima de las barras representan diferencias significativas (P <0,05) en los datos entre varias temperaturas de incubación. (e) Tasa de eclosión normal, cuando los huevos fertilizados recolectados se colocaron en agua de mar a 9 °C durante varios períodos de 50 a 120 minutos y luego se regresaron a la temperatura natural del agua de mar de 18 °C para la incubación. Los asteriscos indican una diferencia significativa en comparación con el grupo de control. **P < 0,01, ****P < 0,0001. (c – e) Los datos se expresan como la media ± SEM (n = 3) y se analizan mediante ANOVA unidireccional seguido de una prueba de comparación múltiple de Turquía. (f) Localización del tinte en cada etapa de desarrollo cuando el tinte fluorescente (solución de KCl 200 mM que contiene 0,05% de dextrano, rodamina B) se microinyectó en la yema o el citoplasma. ( g ) Supervivencia del embrión y eclosión normal después de 24 y 48 h de microinyección en el citoplasma.

A continuación se examinó el lugar de inyección de la solución de edición del genoma. Se inyectó un tinte fluorescente en la yema o el citoplasma del óvulo fertilizado y se observó la transferencia del tinte. El tinte inyectado en la yema permaneció en el sitio de la yema tanto en la mórula como en los alevines después de la eclosión (Fig. 2f, izquierda), mientras que el tinte inyectado en el citoplasma se observó en el embrión en la etapa de mórula y se observó fluorescencia roja. observado en todo el cuerpo en los alevines después de la eclosión (Fig. 2f, derecha). Esto implicaba que la transmisión citoplasmática no se producía en los huevos fertilizados de caballa y que era necesaria la inyección directa en el citoplasma.

El capilar de vidrio utilizado para la microinyección se afiló y adelgazó hasta un diámetro de 1 µm, lo que permitió una administración de la inyección sin problemas. Debido a la alta presión interna de los huevos de caballa, se necesitaría una aguja con un diámetro de punta pequeño para evitar la fuga citoplasmática durante la inyección. Los huevos infundidos con tinte en el disco germinal mostraron una tasa de supervivencia del 86,5% a las 24 y 48 h en comparación con los huevos no tratados (Fig. 2g). La tasa de eclosión normal, en comparación con la de los huevos no tratados, fue del 76,5 %, lo que muestra una tasa de supervivencia de aproximadamente el 80 % (Fig. 2g).

Utilizamos la tecnología de nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) para crear la cepa knockout V1a2. Se microinyectaron ARNm de TALEN izquierdo y derecho, a una concentración de 100 ng/μl cada uno, en el citoplasma de óvulos fertilizados en etapa de 1 o 2 células. Después de 24 h después de la inyección, sobrevivieron 591 óvulos fertilizados microinyectados con ARNm de TALEN. Dado que todos los huevos se mantuvieron en un tanque de cría de alevines, no se pudo determinar el número de eclosiones normales. Al día 24 después de la eclosión, sobrevivieron 52 alevines de la generación V1a2 KO F0. Cinco meses después de la eclosión, sobrevivieron 37 peces y se recogieron las aletas de cada pez y se les genotiparon. El análisis del ensayo de movilidad heterodúplex mostró las mutaciones en el ADN diana de todos los individuos (Fig. 3a). Se realizó un análisis de secuenciación y se seleccionaron una mujer y dos hombres con la tasa más alta de introducción de mutación de cambio de marco para la producción de la generación F1 (Fig. 3b). En los peces, se ha informado que muchos tipos de mutaciones están presentes en un patrón de mosaico en individuos F0 después de la edición del genoma19. Se observaron muchos patrones de mutación por cambio de marco en las regiones genómicas objetivo de los tres peces seleccionados (Fig. 3b).

Producción del linaje knockout V1a2. ( a ) Resultados del análisis del ensayo de movilidad heterodúplex (HMA) de toda la generación V1a2 KO F0 que sobrevivió a los 5 meses de edad. W indica tipo salvaje. NC indica control negativo. (b) La secuencia genética y la secuencia de aminoácidos del sitio objetivo de la generación F0, que tuvo una tasa de mutagénesis particularmente alta y fue seleccionado para la producción de la generación F1 (una hembra y dos machos). El número de etiqueta (#) del individuo coincide con el número del resultado del análisis HMA en (a). Se muestran los resultados de alineación de los datos obtenidos mediante análisis de secuencia de 10 clones de cada pez. Las áreas de reconocimiento de TALEN izquierda y derecha están resaltadas en amarillo. Δ indica una eliminación de bases y más indica una inserción de bases. *indica un codón de terminación. (c) Como resultado del análisis de secuencia de los sitios del gen objetivo de todos los peces F1 que sobrevivieron 5 a 6 meses después de la eclosión, se confirmaron tres patrones de mutación defectuosa y dos patrones de inserción de bases. (d) Desglose de mutantes de ambos alelos en todos los peces F1 secuenciados. En 30 individuos aún se desconoce el genotipo, ya que no se obtuvieron resultados claros del análisis de secuencia.

La generación F1 se produjo durante la temporada de desove de 2018 y 468 peces sobrevivieron después de 5 a 6 meses de eclosión; Los genotipos de todos los peces se confirmaron mediante análisis de secuencia. Se identificaron tres tipos de mutaciones defectuosas y dos tipos de mutaciones de inserción (Fig. 3c). Las mutaciones de deficiencia de 13 bases (Δ13) y de inserción de 6 bases y 10 bases (+ 6 y + 10) fueron variantes que no pudieron confirmarse mediante el análisis de secuencia de los padres de la generación F0 (Fig. 3b). Esto probablemente se debió a que solo se analizaron la secuencia de 10 clones en cada pez F0, y posiblemente se podrían confirmar patrones de mutación más variados analizando más muestras mediante análisis de secuenciación de próxima generación. De todas las cepas F1 analizadas, el 46,4% eran de tipo salvaje, el 42% eran V1a2+/-, que tenían mutaciones introducidas en un alelo, y el 5,1% eran V1a2-/-, lo que confirmó la introducción de mutaciones en ambos alelos (Fig. 3d).

En la generación F2, no todos los peces pudieron convertirse en V1a2 nulo; sin embargo, en la generación F3 producida en 2020, todos los peces eran V1a2 nulos. El análisis de secuencia de los genotipos de 20 alevines de la generación F3, inmediatamente después de la eclosión, reveló mutaciones defectuosas en ambos alelos en todos los individuos (Fig. 4a). Los patrones de mutación fueron (Δ5, Δ5), (Δ13, Δ13) y (Δ5, Δ13) nulos (Fig. 4a); las tasas de aparición fueron del 30%, 25% y 45%, respectivamente. En los patrones de defectos Δ5 y Δ13, los residuos de cisteína que formaron el puente S-S, definido en el sitio objetivo, se perdieron debido al cambio de marco (Fig. 4b). En el caso de una eliminación de 5 bases, se estimó que se produjeron 54 aminoácidos diferentes del V1a2 normal como resultado de una mutación por cambio de marco (Fig. 4b). Por el contrario, en el caso de una deficiencia de 13 bases, apareció un codón de parada inmediatamente después del sitio de introducción de la mutación (Fig. 4b). Aunque el grupo KO heterocigoto tenía diferentes patrones de deleción en ambos alelos, dado que el gen diana estaba inactivado en ambos alelos, se supuso que V1a2 era nulo. En los alevines de la generación F3, la frecuencia del comportamiento agresivo se cuantificó mediante análisis fenotípico.

Establecimiento del linaje knockout V1a2. ( a ) Resultados del análisis de secuencia de sitios de genes objetivo en 20 alevines de la generación F3 inmediatamente después de la eclosión. Se introdujeron mutaciones defectuosas de 5 o 13 bases en ambos alelos en todos los individuos, estableciendo la línea V1a2-/-. (b) Los cambios en la secuencia de aminoácidos de V1a2 debido a mutaciones defectuosas de 5 bases y 13 bases se confirmaron en la generación F3. El asterisco indica un codón de parada.

Desarrollamos un sistema de análisis de contenido de vídeo basado en una técnica informática de bioimagen para la vigilancia objetiva y automática del comportamiento caníbal en un grupo de alevines. El sistema constaba de una cámara de video que capturaría un grupo de alevines en una piscina y un software de computadora que analizaría el video capturado (Fig. 5a). El software detectó comportamientos caníbales como acciones anómalas en el grupo de alevines. Al contar la frecuencia de acciones anómalas durante un período determinado (como una hora), podríamos evaluar con qué frecuencia ocurrieron comportamientos caníbales durante el período. Con la introducción de este software, los experimentadores podrían liberarse de la molestia de comprobar visualmente horas de datos de vídeo. Además, dado que los resultados de la evaluación no dependieron de ninguna observación subjetiva, se pudo obtener evidencia confiable del estudio.

Análisis fenotípico de mutantes. (a) Entorno de grabación de vídeo para alevines. Se prepararon ocho juegos de contenedores de grabación de vídeo y cámaras de vídeo, de modo que se pudieran grabar vídeos simultáneamente en los ocho contenedores. Para capturar su imagen nadando se utilizó un recipiente circular blanco, liso (LB-4139; Nitori, Hokkaido, Japón) con un diámetro de 35 cm y alto contraste con el color del dorso de los alevines. En la parte superior de cada grupo se conectó una cámara de video USB (HD Pro Webcam C920r; Logicool, Tokio, Japón) con una velocidad de cuadros de 30 fps y una resolución de imagen de 1280 × 720, conectada a una PC, y se grabó el video. (b) Comportamiento normal de natación de los alevines (derecha) y momento del comportamiento caníbal, en el que se perturba al grupo de alevines (izquierda). (c) Un ejemplo de la pantalla de resultados del análisis del software; 900 píxeles están alineados horizontalmente y 120 píxeles alineados verticalmente. Un píxel es un cuadro de una imagen en movimiento dividido en un cuadro de imagen fija cada 1/30 s, y 108.000 cuadros resultaron del análisis de imágenes en movimiento durante 1 h. (d) Frecuencia de comportamiento caníbal por hora. *P = 0,0229. (e) Duración de la agresión en una conducta caníbal. f) El número de colisiones con la pared del contenedor por hora. (g) Consumo de oxígeno de alevines WT y KO durante 2 h en las piscinas de grabación de vídeo. ***P = 0,0004. Los datos se expresan como la media ± SEM [n = 25 (WT) y 21 (KO)] y se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas no apareada seguida de una prueba f. WT tipo salvaje, nocaut por KO.

Los alevines de caballa generalmente nadan en grupos en la misma dirección y el software evalúa este estado de natación como un vector de características (los detalles se describen en 'Información complementaria'). Los vectores durante los comportamientos caníbales son diferentes de los de los comportamientos normales, ya que los comportamientos caníbales a menudo muestran movimientos muy grandes y dispersos de los alevines (Fig. 5b). La Figura 5c muestra un ejemplo de la pantalla de resultados del análisis del software, que es una representación bidimensional de cada hora de datos de video. Los datos de vídeo se dividieron en un cuadro de imagen fija cada 1/30 s. Un píxel en la pantalla de resultados representa un fotograma. Es decir, el resultado del análisis de vídeo de una hora se mostró en 108.000 fotogramas. El píxel en la parte superior izquierda representa el primer cuadro y el siguiente a la derecha representa el segundo cuadro. Si avanza 900 fotogramas hacia la derecha (30 s), volverá al borde izquierdo, bajará un paso y volverá a avanzar hacia la derecha durante 900 fotogramas (30 s). La parte inferior derecha es el fotograma 108.000, que está a 3600 s (1 h) del inicio del vídeo. El momento en el que ocurrió un determinado comportamiento caníbal se puede determinar como la marca de tiempo (píxel blanco) en el cuadro de video donde se detectó el vector de características anómalas (Fig. 5c).

El análisis de comportamiento mostró que la frecuencia del comportamiento caníbal por hora se redujo en un 46% en el grupo V1a2 KO que en el tipo salvaje, lo cual fue una diferencia significativa (P = 0,0229) (Fig. 5d). La duración de la agresión no fue significativamente diferente con respecto al tipo salvaje (P = 0,34), pero se redujo en un 26% en el grupo V1a2 KO que en el tipo salvaje (Fig. 5e). El número de colisiones con la pared tampoco fue significativamente diferente con respecto al tipo salvaje (P = 0,3186), pero fue un 39% menor en el grupo V1a2 KO que en el grupo WT (Fig. 5f). La medición de la cantidad de oxígeno disuelto en la piscina antes y después de la filmación del video de 2 h reveló que el consumo de oxígeno fue un 15 % menor en el grupo V1a2 KO que en el tipo salvaje, lo cual fue una diferencia significativa (P = 0,0004) (Fig. 5g ).

Para que la edición del genoma se realice de manera eficiente en peces, es necesario microinyectar un reactivo de edición del genoma en óvulos fertilizados inmediatamente después de la fertilización; por lo tanto, la recolección eficiente de óvulos fertilizados inmediatamente después de la fertilización es una cuestión técnica importante. Nuestro centro de investigación (ABRIC) ya ha desarrollado un sistema eficiente de recolección de huevos fertilizados y un sistema de producción de mutantes para la anchoa japonesa (Engraulis japonicus), un pez teleósteo marino20. En el caso de la caballa, la vitelogénesis progresa suficientemente en las hembras criadas en un pequeño tanque terrestre de varios kilolitros; sin embargo, no se produce la maduración final de los ovocitos ni la ovulación. Sin embargo, la maduración testicular ocurre normalmente en los machos. Esto se debe a que en las hembras cautivas, aunque la hormona luteinizante (LH), que promueve la maduración final de los ovocitos, se produce suficientemente en la glándula pituitaria, la GnRH1, que promueve la liberación de LH, no se secreta en el hipotálamo16. Por lo tanto, cuando se inyecta GnRHa en los músculos de la espalda de hembras cautivas, se induce la maduración final de los ovocitos y el desove en el tanque comienza 34 a 36 h después de la administración. Cuando la temperatura del agua de mar supera los 23 °C, comienza la regresión de los huevos y finaliza el desove17. Al controlar el entorno de reproducción, se puede adelantar la temporada de desove y cambiar el momento de desove. El sistema experimental de edición del genoma de la caballa establecido aquí garantiza que se obtengan muestras homogéneas en una fecha y hora que sea conveniente para el experimentador durante aproximadamente la mitad del año.

La manipulación de la inyección debe realizarse durante la embriogénesis temprana, principalmente en huevos de una célula, poco después del desove y la fertilización o, a más tardar, en huevos de dos células después de la primera división. Retrasar la división es de suma importancia ya que en la mayoría de los casos la división ya ha comenzado cuando los óvulos fertilizados se recolectan y se trasladan al laboratorio para prepararlos para la inyección. Al examinar en detalle las condiciones apropiadas del tratamiento a baja temperatura para retrasar la escisión, la forma de los capilares y el lugar de la inyección, el tiempo de microinyección podría extenderse a aproximadamente el doble del tiempo convencional. Sin embargo, la calidad del óvulo afecta en gran medida la eficiencia de la edición del genoma. En muchas especies de peces, los padres más viejos, más grandes y más nutritivos ponen huevos de alta calidad y muestran una mayor tasa de supervivencia de los alevines21,22. La caballa alcanza la pubertad en 1 año; sin embargo, una hembra grande, mayor de dos años, potencialmente puede poner huevos de alta calidad23. Para obtener óvulos microinyectados para la edición del genoma, sería importante considerar los efectos maternos de los padres reproductores.

Para establecer de manera eficiente animales genéticamente modificados mediante la edición del genoma, es esencial la selección de individuos con el genotipo deseado y su reproducción a través de generaciones. El primer factor que influye en la dificultad del proceso es la eficiencia de transmisión de la línea germinal de los animales del mosaico F0. Los resultados del genotipado utilizando ADN genómico extraído de la aleta caudal sugirieron que las secuencias de tipo salvaje de las tres generaciones F0 parentales seleccionadas para la producción de la generación F1 promediaron el 20% de los diez clones analizados. Por otro lado, el genotipado de todos los individuos de la generación F1 reveló que casi el 50% de los individuos eran completamente de tipo salvaje, lo que era más alto que la estimación teórica. En particular, la proporción de individuos con mutaciones introducidas en ambos alelos en la generación F1 fue del 5,1%, significativamente menor de lo esperado. Sin embargo, dado que no investigamos la proporción de genotipos en huevos fertilizados o alevines inmediatamente después de la eclosión, todavía no podemos discutir en detalle la eficiencia del paso de mutaciones a la generación F1. Aunque no evaluamos los rasgos de los individuos V1a2+/−, podría haber algunos fenotipos con baja agresión incluso en los knockouts heterocigotos. Tal fenotipo puede ser desventajoso en la coexistencia con alevines de tipo salvaje, y muchos individuos V1a2+/- y V1a2-/- pueden haber sido seleccionados juntos en el estudio. De hecho, en la generación F0 de dorada, en la que se introdujo una mutación genética similar a un mosaico mediante la edición del genoma, no hubo diferencias significativas en la tasa de introducción de mutaciones y la proporción de tipos de mutaciones entre las aletas pectorales y las células germinales8. Incluso en el jurel, es poco probable que la eficiencia de la introducción de mutaciones difiera mucho entre las células de la aleta caudal y las germinales. En la etapa actual, no asumimos que pueda haber un problema con la transmisión estable de mutaciones a la siguiente generación en nuestro sistema experimental. Una evaluación detallada de la eficiencia de la introducción de mutaciones en las células germinales de la generación del mosaico F0 sería útil a la hora de realizar la edición del genoma de varios genes de esta especie en el futuro.

El análisis fenotípico de la cepa V1a2 KO reveló que la frecuencia de comportamiento agresivo, incluido el comportamiento caníbal, era aproximadamente la mitad que la del tipo salvaje. En otras palabras, se obtuvo con éxito un fenotipo manejable en la etapa de alevines mediante la edición del genoma de V1a2, según el propósito original de este estudio. El hecho de que el comportamiento caníbal se redujera a la mitad sugirió que la tasa de supervivencia de los alevines podría ser más del doble. Dado que la tasa de supervivencia es un factor importante para la producción de semillas, sería necesario repetir en los próximos años una comparación detallada de las eficiencias de producción entre los mutantes de tipo salvaje y V1a2. Además, dado que el mutante tiene una personalidad más amable que el tipo salvaje, también sería necesaria una evaluación detallada de la tasa de crecimiento y la eficiencia alimenticia. Curiosamente, puede haber estado presente un fenotipo inesperado distinto de la frecuencia reducida de canibalismo. Aunque no hubo una diferencia significativa, la frecuencia de colisiones con la pared del contenedor tendió a disminuir en aproximadamente un 40% debido al rasgo suave. La muerte por colisión con las paredes de las jaulas marinas es un problema para el atún, que es una especie muy relacionada con la caballa, debido a su alta velocidad de nado; Actualmente se están realizando investigaciones para el desarrollo de mutantes con baja agilidad24. Los rasgos suaves también pueden contribuir a una reducción de la mortalidad por colisiones en sitios de acuicultura. Además, también se sugirió que la cepa mutante V1a2 consumiera menos oxígeno que la cepa de tipo salvaje. Aunque aún se desconoce el motivo de esto, se considera que la cantidad de natación activa es menor en el mutante que en el tipo salvaje. Se han informado en todo el mundo daños catastróficos a la acuicultura debido a las mareas rojas25,26. Aunque aún se desconoce el mecanismo detallado de la muerte por marea roja, se considera que las algas causantes de crecimiento excesivo privan a los peces de su capacidad de transportar oxígeno en la sangre, como resultado de lo cual, los peces luchan y se vuelven deficientes en oxígeno para evitar las mareas rojas27 . La cepa mutante V1a2 posiblemente podría ser más resistente a condiciones hipóxicas, como cuando ocurre la marea roja, que la cepa salvaje. En el futuro, se aclararán varias ventajas de este método de reproducción mediante la realización de evaluaciones de rasgos más multifacéticas.

En este estudio, se desarrolló un sistema experimental que permite la recolección eficiente de huevos y la edición del genoma en caballa. Los alevines de caballa, cuyo genoma fue editado en V1a2, tenían la mitad del comportamiento caníbal que el tipo salvaje. La cría de este rasgo amable y manejable sería extremadamente beneficiosa para la domesticación y la producción eficiente de peces silvestres. Por otro lado, aunque logramos producir una variedad de caballa con una personalidad amable, no investigamos si la tasa de supervivencia mejoró y se necesitan más investigaciones en el futuro. Esperamos que la implementación de esta raza contribuya al desarrollo de una producción de productos marinos estable y sostenible.

En mayo de 2015, para obtener huevos fertilizados durante la temporada normal de desove, peces de 2 años comprados en una piscifactoría en la prefectura de Oita fueron transferidos al Laboratorio de Investigación Pesquera de la Universidad de Kyushu y trasladados a un tanque de concreto de 3 kL. con agua de mar corriente. Para el experimento de recolección temprana de huevos, se compraron peces de 2 años de una piscifactoría en la prefectura de Saga en diciembre de 2015 y se transfirieron al satélite ABRIC Karatsu de la Universidad de Kyushu. Para la inducción del desove, una etilamida de GnRHa [des-Gly10-(D-Ala6) LHRH, 400 μg/kg de peso corporal; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.], suspendido en manteca de cacao, se inyectó en el músculo posterior del pez. Los huevos de desove se recolectaron utilizando una red fijada a la salida de drenaje del tanque de desove. Dado que los huevos fertilizados flotan en la superficie del agua de mar mientras que los huevos no fertilizados se hunden, los huevos recolectados se transfirieron a una probeta medidora y se dejaron reposar por un tiempo para separar los huevos fertilizados de los no fertilizados. Finalmente, se recogieron y contaron los huevos fertilizados flotantes.

El 4 de diciembre de 2015, los peces fueron trasladados a un tanque de plástico reforzado con fibra (FRP) de 5 kL con una cortina opaca. Se instalaron cinco bombillas LED de 760 lm en el techo de la cortina opaca y se ajustaron para un fotoperiodo de día largo (LD, 14L:10D). Las luces se ajustaron, mediante un temporizador, para encenderse a las 05.00 h y apagarse a las 19.00 h. Para evitar colisiones con la pared por la noche, se instaló una pequeña bombilla LED (45 lm) como luz nocturna. El brillo cerca de la superficie del agua fue de aproximadamente 400 lx para todas las luces. La temperatura del agua se ajustó entre 18 y 19 °C, correspondiente a la temporada de desove, utilizando un calentador de serpentín de titanio. Para obtener huevos fecundados durante el día, se cambió el fotoperiodo una semana antes de la inducción del desove, de modo que las luces se apagaron a las 07:00 h y se encendieron a las 17:00 h.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando una biblioteca de ADNc preparada a partir del cerebro, como plantilla, para obtener una secuencia parcial de V1a2 del primer exón deducido. El ciclado térmico consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 9 min, seguida de 35 ciclos a 95 °C durante 15 s, 50 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s. La polimerasa utilizada fue la incluida en AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), y el contenido de la mezcla de reacción estuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores utilizados son las siguientes: Fw, 5ʹ-TGGTCGCCTTCTTCCAGGTGCTAC-3ʹ y Rv, 5ʹ-CCAATCATCCGTTCTTACTCGCAG-3ʹ.

Los plásmidos TALEN de platino se construyeron utilizando el kit Platinum Gate TALEN (Addgene; kit n.º 1000000043), como se describió anteriormente28; ptCMV-153/47-VR fue un vector de destino. El par TALEN se diseñó para apuntar al sitio de unión S-S, que conservaba la conformación de V1a2. Las secuencias objetivo de TALEN son las siguientes: izquierda, 5'-TTCCGCTTCTATGGTCCA-3' y derecha, 5'-TGGAGGTGTTTGACTAT-3'. Para preparar los ARNm de TALEN, los plásmidos TALEN izquierdo y derecho se linealizaron con SmaI y se purificaron utilizando un kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen, Aarhus, Dinamarca). Los ARNm se sintetizaron y purificaron utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA (Thermo Fisher Scientific) y el kit RNeasy Mini (Qiagen), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las microagujas se crearon utilizando un extractor de micropipetas PC-10 (Narishige, Tokio, Japón) para estirar un tubo de vidrio con un núcleo (GD-1; Narishige). Usando una microamoladora EG-400 (Narishige), el diámetro de la punta se redujo a aproximadamente 1 µm y la punta de la aguja se afiló hasta un ángulo agudo de 20°. Los huevos fertilizados recolectados se dispusieron cuidadosamente en las ranuras de una agarosa al 1,5% endurecida en una placa de Petri de plástico de 15 cm de diámetro bajo un estereomicroscopio y se llenaron con agua de mar filtrada. A continuación, se inyectó una solución de KCl 200 mM que contenía dextrano al 0,05 % (p/v) y rodamina B (Thermo Fisher Scientific) y se investigó la localización del tinte en cada etapa de desarrollo. Se capturaron imágenes de huevos de campo brillante utilizando una cámara Nikon DS-Fi2 (Nikon, Tokio, Japón) montada en un estereomicroscopio SZX7 (Olympus, Tokio, Japón). Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron utilizando un microscopio de barrido láser confocal LSM-700 (Carl Zeiss, Jena, Alemania).

La generación F0 se produjo el 4 y 5 de mayo y el 16 de junio de 2017. Poco después del desove, se recolectaron huevos fertilizados y se preincubaron a 9 °C en agua de mar filtrada para retrasar el desarrollo embrionario hasta la microinyección. Antes de la inyección, la solución de ARNm de TALEN se diluyó a una concentración de 100 ng/μl usando una solución de KCl 200 mM y se añadió rojo de fenol (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) a una concentración final de 0,25 % para la visualización durante la microinyección. Se inyectó ARNm de TALEN en los discos germinales de huevos en etapa de 1 y 2 células, se transfirió a agua de mar esterilizada en una cámara de vidrio de 5 litros y se incubó a 18 °C. La microinyección se realizó durante tres días y 591 huevos sobrevivieron 24 h después de la inyección. Los huevos supervivientes se trasladaron a un tanque de policarbonato de 100 litros.

Los peces se anestesiaron con 200 ppm de 2-fenoxietanol (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón) y se cortó una parte de las aletas caudales con unas tijeras afiladas. Todos los individuos fueron identificados insertando una etiqueta PIT (BIO8; Biomark, Boise, ID, EE. UU.) en el músculo de la espalda. Para detectar mutaciones indel, se realizó un ensayo de movilidad heterodúplex y se secuenciaron los amplicones que contenían el sitio objetivo. Las aletas se lisaron en solución alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) durante 5 minutos a 98 °C y se neutralizaron con un neutralizador (Tris-HCl 1 M, pH 6,8). Se amplificó mediante PCR un fragmento corto, incluido el sitio objetivo de los TALEN. Las secuencias de los cebadores utilizados son las siguientes: Fw, 5ʹ-CACCTCAGACCTGGCCGAC-3ʹ y Rv, 5ʹ-ACGGTCCAGGGTCATCATCAC-3ʹ. Los amplicones resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 15% (Fujifilm). El producto de la PCR se purificó, se ligó al vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, EE. UU.), se transformó en células competentes JM109 (Takara, Shiga, Japón) y estas últimas se extendieron en medio de agar. Las colonias obtenidas se seleccionaron al azar, se realizó una PCR y se secuenciaron aproximadamente 10 colonias transformadas (Eurofins Genomics Japan, Tokio, Japón). Las muestras se prepararon según las instrucciones del fabricante. Se realizaron múltiples alineamientos de secuencias genéticas con el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) X (Versión 10.1.8) utilizando el algoritmo ClustalW (https://www.megasoftware.net) de MEGA X. A los individuos seleccionados se les administró GnRHa y Se le permite reproducirse espontáneamente en tanques interiores terrestres de 3 o 5 kL para la producción de próxima generación.

El análisis de comportamiento se realizó utilizando alevines de la generación F3 (22 días después de la eclosión; longitud corporal promedio 29,04 ± 1,05 mm; peso corporal promedio 0,27 ± 0,03 g), en los que V1a2 fue eliminado en ambos alelos. Los alevines WT comparativos utilizados tenían una edad de 20 días después de la eclosión, con una longitud corporal promedio de 31,6 ± 1,13 mm y un peso corporal promedio de 0,28 ± 0,03 g. Los alevines criados en un tanque de policarbonato de 500 l se recogieron suavemente con una red y se colocaron en un recipiente que contenía 5 l de agua de mar (Fig. 5a). La profundidad del agua era de aproximadamente 15 cm. Dado que no se puede realizar la aireación durante la grabación del vídeo, se inyectó oxígeno lentamente en la piscina, durante aproximadamente 20 minutos, de modo que el contenido de oxígeno disuelto del tanque de agua fuera de 15 mg/l para evitar la deficiencia de oxígeno. Dado que el software de análisis sólo podía rastrear hasta 15 alevines, se seleccionaron visualmente para el experimento diez alevines relativamente grandes y cinco relativamente pequeños, garantizando así la posibilidad de peleas. Las ventanas de la habitación se cubrieron con una cortina opaca para evitar la entrada de luz exterior y la temperatura de la habitación se fijó en 19 °C, imitando la temperatura natural del agua de mar. Para evitar el reflejo de la luz fluorescente en la superficie del agua de la piscina, se iluminaron cuatro reflectores LED (LD106; Good Goods, Osaka, Japón) en la pared blanca (Fig. 5a). El video fue filmado durante 120 min en cada piscina; los primeros 30 min fueron para tiempo de aclimatación y los últimos 30 min para observación de los peces debilitados; los datos de vídeo restantes de 60 minutos se utilizaron para el análisis. El video se grabó durante cuatro días consecutivos y se obtuvieron datos de video para análisis durante un total de 25 h en el grupo WT y 21 h en el grupo KO, correspondientes a aproximadamente 1 día en un tanque de cría de alevines. En el grupo KO, perdimos datos de vídeo de 4 h debido a una corrupción inesperada de los datos. La cantidad de oxígeno disuelto en la piscina se midió en todos los contenedores al principio y al final de la toma de imágenes utilizando un medidor de OD (YSI ProSolo; Xylem, Kanagawa, Japón), y se calculó el consumo de oxígeno. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas para experimentos con animales de la Universidad de Kyushu, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Universidad de Kyushu. Nuestro manuscrito confirma que el estudio se informó de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

El principio detallado de la detección de comportamientos anormales se explica en el archivo complementario.

Se utilizó Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) para la creación de gráficos y el análisis de datos.

La información de secuencia generada y analizada durante el estudio actual está disponible en el repositorio del Banco de datos de ADN de Japón (DDBJ) [Número de acceso: LC722364].

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Los autores desean agradecer al personal de ABRIC por su ayuda en el mantenimiento de las especies de peces y al personal del Laboratorio de Investigación Pesquera (Universidad de Kyushu) por su amable ayuda con este estudio. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Programa Interministerial de Promoción de la Innovación Estratégica (SIP), apoyado por la Oficina del Gabinete; Fondo Conjunto de Investigación del Proyecto de Investigación sobre Creación de Nuevos Recursos Pesqueros, apoyado por la ciudad de Karatsu; Subvenciones para investigación científica (KAKENHI: JP15H02459; JP16H06280; JP19H00951), respaldadas por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT), Japón; Beca de apoyo a la investigación, respaldada por el Centro de Educación e Investigación en Matemáticas y Ciencias de Datos de la Universidad de Kyushu (Japón).

Centro de Innovación Aqua-Bioresource (ABRIC) Satélite Karatsu, Facultad de Agricultura, Universidad de Kyushu, Saga, 847-0132, Japón

Hirofumi Ohga

Laboratorio de Biología Marina, Facultad de Agricultura, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 819-0395, Japón

Koki Shibata, Ryo Sakanoue, Takuma Ogawa, Satoshi Kai y Kohei Ohta

Tercer Grupo de Pesca, Centro de Investigación y Desarrollo de la Pesca Marina, Agencia Japonesa de Investigación y Educación Pesquera (FRA), Kanagawa, 221-8529, Japón

Hajime Kitano

Laboratorio de Acuicultura, Facultad de Agricultura, Universidad de Miyazaki, Miyazaki, 889-2192, Japón

Naoki Nagano

Laboratorio de Interfaz Humana, Fábrica de Ciencias de la Información e Ingeniería Eléctrica, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 819-0395, Japón

Tomoya Nagasako y Seiichi Uchida

Laboratorio de Genética Molecular, Escuela de Graduados en Ciencias Integradas para la Vida, Universidad de Hiroshima, Hiroshima, 739-8526, Japón

Tetsushi Sakuma y Takashi Yamamoto

Laboratorio de Técnicas de Genética Molecular, Facultad de Agricultura, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 812-8581, Japón

Sangwan Kim, Kosuke Tashiro y Satoru Kuhara

Departamento de Planificación y Coordinación, Instituto de Tecnología Pesquera, FRA, Nagasaki, 851-2213, Japón

Koichiro Gen

División de cría acuática, Departamento de investigación en acuicultura, Instituto de tecnología pesquera, FRA, Mie, 516-0193, Japón

Atushi Fujiwara

Instituto de Tecnología Pesquera, Estación de Campo Minamiizu, FRA, Shizuoka, 415-0156, Japón

Yukinori Kazeto

División de cría acuática, Departamento de investigación en acuicultura, Instituto de tecnología pesquera, FRA, Kanagawa, 236-8648, Japón

Takanori Kobayashi

ABRIC, Facultad de Agricultura, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 819-0395, Japón

Michiya Matsuyama

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HO gestionó todo el proceso de investigación y escribió el manuscrito original. HO, KS, RS y TO participaron en el establecimiento de los sistemas experimentales, la creación de la cepa knock-out y la evaluación de rasgos. Hong Kong proporcionó cooperación técnica para la cría de alevines mutantes. S. Kai, KO y NN brindaron asistencia técnica. TN y SU desarrollaron el software de análisis de vídeo y escribieron la parte técnica del manuscrito. TS y TY construyeron TALEN para la edición del genoma. S.Kim, KT y S.Kuhara participaron en la adquisición de secuencias del genoma. KG, AF, YK y TK participaron en la recopilación de información del genoma y la selección de genes diana. MM diseñó el concepto, ayudó con la interpretación de los datos y supervisó este estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Michiya Matsuyama.

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Ohga, H., Shibata, K., Sakanoue, R. et al. Desarrollo de una caballa con etapa de alevines menos agresiva mediante la edición del genoma del receptor de arginina vasotocina V1a2. Representante científico 13, 3190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30259-x

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Recibido: 02 de agosto de 2022

Aceptado: 20 de febrero de 2023

Publicado: 23 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30259-x

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