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Jul 07, 2023

Las superficies de proteínas fortuitamente compatibles prepararon el control alostérico en la fotoprotección de cianobacterias

Nature Ecology & Evolution volumen 7, páginas 756–767 (2023)Cite este artículo 3769 Accesos 2 Citas 136 Detalles de Altmetric Metrics Las interacciones altamente específicas entre proteínas son fundamentales

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Detalles de métricas

Las interacciones altamente específicas entre proteínas son un requisito previo fundamental para la vida, pero cómo evolucionan sigue siendo un problema sin resolver. En particular, las interacciones entre proteínas inicialmente no relacionadas requieren que desarrollen superficies coincidentes. No está claro si tales compatibilidades superficiales sólo pueden construirse mediante selección en pequeños pasos incrementales, o si también pueden surgir de manera fortuita. Aquí, utilizamos filogenética molecular, reconstrucción de secuencias ancestrales y caracterización biofísica de proteínas resucitadas para rastrear la evolución de una interacción alostérica entre dos proteínas que actúan en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias. Mostramos que esta interacción entre la proteína carotenoide de naranja (OCP) y su regulador no relacionado, la proteína de recuperación de fluorescencia (FRP), evolucionó cuando las cianobacterias adquirieron horizontalmente un precursor de FRP. Los precursores del FRP ya podían interactuar y regular el OCP incluso antes de que estas proteínas se encontraran por primera vez en una cianobacteria ancestral. La interacción OCP-FRP explota una antigua interfaz de dímero en OCP, que también es anterior al reclutamiento de FRP en el sistema de fotoprotección. En conjunto, nuestro trabajo muestra cómo la evolución puede crear fácilmente sistemas regulatorios complejos a partir de componentes preexistentes.

Las interacciones alostéricas entre proteínas son una forma ubicua de regulación bioquímica en la que el sitio activo de una proteína se ve afectado por la unión de otra proteína a un sitio distal1. Cómo evolucionan tales interacciones es un problema sin resolver en la bioquímica evolutiva. Requiere que ambas proteínas (el regulador y la diana) desarrollen una interfaz coincidente, así como algún mecanismo que traduzca la unión del regulador a un cambio en el sitio activo de la proteína diana. Si todos los residuos que participan en esta interfaz y el mecanismo de transmisión tienen que evolucionar de novo, construir tal interacción requeriría varias sustituciones en ambas proteínas. Debido a que es muy poco probable que las trayectorias genéticas largas que involucran varias sustituciones en múltiples proteínas sean fijadas por deriva genética aleatoria, generalmente se supone que las interacciones existentes se han construido en pasos mutacionales incrementales. Cada paso agregaría un único residuo interactuante y sería impulsado a la fijación por la selección natural que actúa directamente sobre una función asociada con la interacción2. Sin embargo, en algunos sistemas proteicos, las interfaces o vías alostéricas preexistieron fortuitamente en uno de los dos socios3,4,5,6. Esto indica que algunos aspectos de estas interacciones surgieron por casualidad, que luego fueron aprovechados por otros componentes que surgieron posteriormente.

Aún no está claro hasta qué punto es necesaria la selección directa para dar forma a estos componentes restantes de una interacción, como la superficie de interacción de un nuevo regulador que explota una superficie preexistente en su objetivo. En principio, estas características también podrían ser completamente accidentales si inicialmente se solucionaron por razones no relacionadas con la interacción. En todos los casos bien estudiados no podemos responder a esta pregunta porque ambos componentes se originaron dentro del mismo genoma donde el objetivo y el regulador siempre se habrían encontrado, por lo que la selección puede haber actuado o no para adaptar el regulador a su nuevo objetivo3. 4,5,6. Por lo tanto, aún se desconoce si alguna interacción biológicamente significativa surgió realmente por casualidad.

Aquí abordamos este problema estudiando la evolución de una interacción alostérica en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias7,8. Los organismos fotoactivos deben protegerse de la irradiación intensa de luz que causa fotodaños. En las cianobacterias, esta protección está mediada por la proteína carotenoide naranja (OCP)9,10, un sensor fotoactivo de intensidad de luz con un carotenoide incrustado simétricamente en sus dos dominios que es capaz de cambiar la conformación de un naranja inactivo (OCPO) a un rojo activado. Estado (OCPR) en condiciones de mucha luz11. La OCPR activada se une al complejo de antenas captadoras de luz de las cianobacterias, el ficobilisoma, para disipar el exceso de excitación del ficobilisoma en forma de calor11,12. Dos parálogos de OCP (OCP2 y OCPx) pueden desprenderse del ficobilisoma y recuperarse pasivamente en OCPO en la oscuridad11,13. Sin embargo, el parálogo más común de OCP1 se basa en una regulación alostérica para la fotorrecuperación: OCP1 interactúa con la proteína de recuperación de fluorescencia (FRP), un pequeño regulador dimérico que finaliza la interacción con el ficobilisoma y acelera fuertemente la retroconversión de OCPR. al estado naranja en reposo14,15 (Fig. 1a). Aunque recientemente se ha demostrado la probable evolución de OCP a partir de precursores no fotoconmutables16, aún no se sabe cómo se reclutó el FRP en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias como un nuevo regulador alostérico.

a, Mecanismo de fotoprotección mediada por OCP exclusiva de cianobacterias que implica control alostérico por FRP (cian) en parálogos de OCP1. Estructuras utilizadas (PDB ID): 7EXT (ref. 57), 3MG1 (ref. 58), 4JDX (ref. 25) y 7SC9 (ref. 29). PBS, fitosbilisoma. b, Filogenia ML reducida de parálogos de OCP con velocidad relativa de recuperación de la fotoconversión indicada, y proteínas ancestrales reconstruidas (Anc) de clados seleccionados. Las CTDH cianobacterianas son el grupo externo. Los números en negrita cuentan los taxones de los parálogos de OCP designados. Los números en cursiva son probabilidades de arranque de Felsenstein de 100 réplicas. La longitud de las ramas representa sustituciones promedio por sitio. El árbol completo se muestra en Datos ampliados Fig. 1. c, Espectros de absorción ultravioleta-visible del estado naranja inactivo y rojo activo de AncOCPall en comparación con el OCP1 existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3; líneas discontinuas). d – f, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales a 20 °C con (cian) o sin SYNY3 FRP (negro) y respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) con sd de tres réplicas independientes: AncOCPall (d), AncOCP1 y 2 (e ) y AncOCP1 (f). Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos.

Para rastrear los orígenes evolutivos de la interacción alostérica de OCP1 con FRP, primero buscamos comprender cómo evolucionaron los parálogos de OCP y cuándo adquirieron la capacidad de ser regulados por FRP. Recientemente se ha demostrado que el primer OCP probablemente evolucionó a través de un evento de fusión genética de dos proteínas pequeñas y que la adición de un conector proporcionaba capacidad de fotoconmutación16. Todavía se pueden encontrar homólogos de estas proteínas de dominio único en las cianobacterias existentes, y se les ha denominado proteínas carotenoides helicoidales (HCP) y homólogos de dominio C-terminal (CTDH) que presentan un pliegue común de proteínas del factor de transporte nuclear 2 (NTF2)17. . Primero inferimos una filogenia de máxima probabilidad (ML) de las proteínas OCP, utilizando secuencias CTDH de cianobacterias como grupo externo para enraizar nuestro árbol (Fig. 1b y Datos ampliados Fig. 1). Describimos además un enraizamiento alternativo utilizando secuencias HCP en la figura 2 de datos extendidos. Nuestro árbol filogenético es prácticamente idéntico a un árbol publicado recientemente16, con OCPx, OCP2 y OCP1 formando cada uno grupos monofiléticos bien soportados. OCP1 y OCP2 son grupos hermanos, con exclusión de todos los demás OCP. Dos clados más no caracterizados se ramifican entre el grupo OCPx y OCP1 y OCP2, que podrían ser OCPx adicionales o representar parálogos separados.

Utilizamos la reconstrucción de secuencias ancestrales para inferir las secuencias de aminoácidos de los OCP ancestrales en los nodos internos de nuestro árbol y a lo largo del linaje hacia el OCP1 regulado por FRP. Nos centramos en tres proteínas desde el último ancestro común (LCA) de todos los OCP existentes (AncOCPall) hasta el LCA de los parálogos de OCP1 y OCP2 (AncOCP1 y 2) hasta el LCA del OCP1 existente (AncOCP1), que se reconstruyeron con probabilidades posteriores promedio a lo largo de sitios entre 0,92 y 0,96 (Fig. 1b y Datos ampliados Fig. 3a-e). Resucitamos estas proteínas OCP ancestrales de forma heteróloga en Escherichia coli y las purificamos para su caracterización in vitro. Todos los OCP ancestrales son sensores de intensidad de luz fotoconmutables con una equinenona unida como carotenoide favorito (Fig. 1c y Datos ampliados Fig. 4a-h). AncOCPall muestra una constante de tiempo moderada para la retroconversión de OCPR a OCPO de 166 ± 10 s (similar al OCP2 existente, ref. 16). La constante de recuperación disminuye a 20 ± 1 s en AncOCP1 y 2 (más rápido que los OCP existentes), pero aumenta drásticamente en AncOCP1 a 314 ± 8 s (como en el OCP1 existente) (Fig. 1d – f y Datos ampliados Fig. 4i – l). Nuestros datos muestran que la recuperación fotográfica lenta es una característica que evolucionó a lo largo de la rama hacia OCP1, consistente con la teoría de que solo los parálogos de OCP1 requieren FRP para una recuperación acelerada alostéricamente.

Luego probamos el efecto de un FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 sobre los tiempos de recuperación de nuestros OCP ancestrales. Los dos ancestros anteriores no se ven afectados por FRP, mientras que AncOCP1 solo puede recuperarse rápidamente en presencia de FRP (en proporciones molares de cinco OCP a un FRP), lo que acelera la retroconversión de OCPR a OCPO en aproximadamente un 97% (similar a OCP1 existente) (Fig. 1d – f y Datos ampliados Fig. 4m – t). Como AncOCP1&2 no se ve afectado por FRP, la aceleración alostérica de la recuperación de OCP evolucionó después del evento de duplicación genética que dio lugar a los parálogos de OCP1 y OCP2, solo a lo largo de la rama a OCP1.

Probamos la solidez de nuestras conclusiones sobre las incertidumbres estadísticas en nuestras secuencias resucitadas resucitando adicionalmente una secuencia alternativa menos probable, pero aún estadísticamente plausible, por ancestro (ver Métodos para más detalles). Las caracterizaciones biofísicas de estas proteínas OCP ancestrales alternativas confirman que la recuperación lenta y la aceleración por parte de FRP evolucionaron a lo largo de la rama que conduce a OCP1 (Datos ampliados, figuras 5a-l).

Luego preguntamos cuándo apareció por primera vez FRP en los genomas de cianobacterias, en relación con la duplicación de genes que produjo OCP1 regulado por FRP. Para responder a esto, inferimos una filogenia de especies de ML de cepas de cianobacterias que contienen OCP que se encuentran en nuestro árbol de OCP y mapeamos la presencia de parálogos de FRP y OCP en él (Datos ampliados, figura 6). Prácticamente todos los genomas que contienen OCP1 también contienen FRP, lo que sugiere que FRP se obtuvo cerca de la duplicación que produjo OCP1. Es difícil decir exactamente en qué parte de la filogenia de la especie ocurrieron las sucesivas duplicaciones de OCP, porque los parálogos de OCP2 y OCPx tienen distribuciones muy esporádicas, y las relaciones dentro de cada clado de OCP están mal resueltas. Las gloeobacterias, que en nuestra filogenia de especies y en las de otros18,19,20,21 son hermanas de todas las demás cianobacterias, solo poseen OCPx, mientras que los grupos que se ramifican inmediatamente después ya tienen OCP1 y FRP u OCP2 o ambos. Esto sugiere que la duplicación que produjo OCP1 y OCP2 ocurrió relativamente rápido después de que Gloeobacter spp. se separó de todas las demás cianobacterias y ese FRP se reclutó en el sistema casi al mismo tiempo.

Nuestro siguiente objetivo era comprender el origen del FRP. También se pueden encontrar homólogos de FRP (denominados similares a FRP, FRPL) en bacterias lejanamente relacionadas8,22, principalmente proteobacterias y acidobacterias, lo que sugiere un origen mucho más allá de las cianobacterias. Para probar esta teoría, buscamos exhaustivamente homólogos de FRP dentro y fuera de las cianobacterias e inferimos una filogenia de ML. Nuestro árbol presenta una división altamente compatible entre todos los FRP y todos los FRPL (Fig. 2a). Un pequeño grupo de FRPL proteobacterianos delta se ramifica más cerca del grupo de FRP cianobacteriano con un alto respaldo estadístico (prueba de índice de probabilidad aproximada (aLRT) = 60,9, expectativas de arranque de transferencia (TBE) de 0,99). Sin embargo, en algunas ejecuciones de arranque, los FRPL de otros taxones bacterianos con ramas terminales largas saltan a este grupo, lo que resulta en un soporte de arranque deficiente de Felsenstein (FBP = 0,51), pero los FRPL proteobacterianos delta siguen siendo hermanos del FRP en todas las ejecuciones. Otros FRPL se distribuyen esporádicamente en proteobacterias y acidobacterias, y se encuentran principalmente en especies no cultivadas (y están completamente ausentes en organismos modelo). Dentro de diferentes grupos de proteobacterias, nuestro árbol se resuelve mal, probablemente debido a la corta longitud de las proteínas FRP y FRPL.

a, Filogenia ML reducida de FRP cianobacteriano (cian) y proteínas FRPL homólogas con las examinadas en este estudio indicadas por un círculo magenta y el nombre de su especie huésped. Los números en negrita cuentan taxones de grupos bacterianos colapsados. El número en cursiva indica TBE de 100 réplicas. El árbol tenía sus raíces entre proteobacterias y acidobacterias, e indica una HGT entre delta-proteobacterias y cianobacterias (línea roja). Las longitudes de las ramas representan sustituciones promedio por sitio. El árbol completo se muestra en la Fig. 1 complementaria. b, Estructura cristalina del homodímero FRPL de P. borbori a 1,8 Å con los dominios de cabeza indicados (PDB ID 8AG8) c, Superposición rotada con FRP (PDB ID 4JDX de Synechocystis sp .PCC 6803, ref.25). rmsd, desviación cuadrática media.

Arraigamos el árbol entre acidobacterias y proteobacterias dentro del grupo FRPL como la hipótesis de raíz más parsimoniosa. Esta raíz indica una transferencia horizontal de genes (HGT) de una delta-proteobacteria ancestral a una cianobacteria ancestral, y además indica muchas pérdidas esporádicas de FRPL en acidobacterias y proteobacterias (Fig. 2a). Por el contrario, una raíz dentro del grupo FRP requeriría eventos HGT cada vez menos plausibles: al menos de cianobacterias a sólo un pequeño conjunto de proteobacterias, luego a acidobacterias y luego de acidobacterias relativamente modernas a proteobacterias tempranas. Una raíz entre FRP y FRPL requeriría un origen de la proteína en el LCA de todas las bacterias23, lo que indicaría pérdidas en muchos grupos bacterianos grandes, así como la misma transferencia temporalmente inverosímil de las acidobacterias modernas al LCA de las proteobacterias (consulte la Discusión complementaria para detalles). Como consecuencia, nuestros resultados indican que lo más probable es que el FRP fuera adquirido horizontalmente por una cianobacteria ancestral en las primeras etapas de la historia de las cianobacterias.

Para comprender el estado ancestral de las proteínas FRPL antes de que fueran transferidas a cianobacterias, expresamos, purificamos y caracterizamos heterólogamente el FRPL de una de las pocas bacterias mesófilas aisladas que presentan FRPL (PbFRPL): la gamma-proteobacteria Pseudomonas borbori, un pariente cercano. de P. aeruginosa24. La espectroscopia de dicroísmo circular de PbFRPL mostró el típico pliegue alfa-helicoidal, encontrado previamente en FRP en solución, y la espectrometría de masas nativa confirmó el estado dimérico distintivo8,14 (Datos ampliados, figuras 7a-c). Resolvimos la estructura cristalina de PbFRPL con una resolución de 1,8 Å (Tabla 1). El dominio N-terminal consta de dos hélices alfa antiparalelas de aproximadamente 50 Å de longitud y presenta una interfaz de homodimerización similar a las de los FRP con una superficie enterrada estimada de alrededor de 675 Å2. El dominio de la cabeza C-terminal, que en FRP se cree que interactúa con OCP1 (refs. 25,26,27), también está presente en PbFRPL y constituye tres hélices alfa entrelazadas. En general, PbFRPL y FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (Banco de datos de proteínas (PDB) ID 4JDX, ref. 25) se superpone con una desviación cuadrática media de 2,08 Å (Fig. 2b, c). Por tanto, las propiedades estructurales del PbFRPL son extremadamente similares a las del FRP cianobacteriano.

No está claro qué función llevan a cabo los FRPL, pero no puede regular el OCP porque los genomas que contienen FRPL no contienen OCP ni homólogos de su dominio N-terminal o proteínas similares a CTD (HCP y CTDH, respectivamente). En P. borbori, el gen frpl está codificado en su único cromosoma y no encontramos ningún homólogo de OCP, HCP o CTDH (Datos ampliados, figura 7d). La microscopía de epifluorescencia de PbFRPL fusionada a un fluoróforo mVenus y expresada a partir de un plásmido bajo su promotor nativo en P. borbori mostró una distribución homogénea en toda la célula durante el crecimiento exponencial y una concentración adicional en los polos celulares tras la inanición con aumento de células enteras. fluorescencia integrada aproximadamente de 2,5 a 3,4 veces por encima del aumento de tipo salvaje (Datos ampliados, figuras 7e-g). Teniendo en cuenta que aquí no podemos controlar el número de copias de proteínas, es notable que la localización y la cantidad de PbFRPL cambian en respuesta a la inanición. Nuestros datos indican que a pesar de sus estructuras extremadamente similares, los FRPL llevan a cabo una función potencialmente relacionada con el estrés que no debe tener ninguna relación con los OCP y la regulación de la fotoprotección.

El pliegue compartido de FRPL y FRP sugiere que los FRPL pueden interactuar productivamente con OCP, lo que significa que es posible que no hayan necesitado modificaciones adicionales después de ser transferidos a cianobacterias para funcionar inmediatamente en su sistema de fotoprotección. Para probar esto, purificamos varios FRPL de especies existentes y examinamos su efecto en la fotorrecuperación de OCP1 existente. Elegimos FRPL de cuatro organismos que abarcan la diversidad de grupos bacterianos que contienen FRPL en nuestro árbol filogenético: P. borbori, Methylocaldum sp. (otra gamma-proteobacteria), Chlorobi sp. (una especie del grupo FCB) y una delta-proteobacteria de la familia Desulfobacteraceae, que representa una de las secuencias existentes más cercanas al evento HGT en las cianobacterias de nuestro árbol (Fig. 2a). FRPL de P. borbori, Methylocaldum sp. y Clorobi sp. prácticamente no tuvo ningún efecto en la recuperación de la foto de OCP1. Sin embargo, Desulfobacteraceae FRPL mostró la aceleración típica de la recuperación de OCP1 de la fotoconversión en aproximadamente un 93% (cuando se incuba en una proporción equimolar de OCP1 a FRPL), en comparación con OCP1 solo (Fig. 3a, by Datos ampliados Fig. 7h-k) . Esto indica que la capacidad de regular OCP1 ya existía en el momento del evento HGT que transfirió por primera vez FRP a las cianobacterias. Para probar aún más esta teoría, también resucitamos dos proteínas ancestrales: FRPLpreHGT, que es el último FRPL que podemos reconstruir antes del evento HGT, y FRPpostHGT, que representa el LCA de todos los FRP en cianobacterias después del HGT (Fig. 3c). Ambas proteínas ancestrales también muestran el efecto típico de aceleración de FRP en la foto-recuperación de OCP1, funcionando casi tan bien como el FRP existente (Fig. 3d, ey Datos ampliados Fig. 8a-d). Esta inferencia es aún más sólida para las proteínas ancestrales FRP y FRPL ancestrales con secuencias ligeramente diferentes que, sobre la base de una filogenia inicial de FRP (L), habíamos inferido anteriormente con menos secuencias en total (Datos ampliados, figuras 8e-j).

a, b, Recuperación de la fotoconversión de OCP1 existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con FRPL existente de P. borbori (a) o una especie de Desulfobacteriaceae (Desulfo.) (b) en diferentes relaciones molares como se indica a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres independientes replica. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos. ND, no determinable. c, Filogenia esquemática de FRP (L) con proteínas ancestrales reconstruidas y FRPL existentes probados. El árbol completo se muestra en la Fig. 1 complementaria. d, e, Recuperación de la fotoconversión del SYNY3 OCP1 existente con FRPL ancestral (FRPLpreHGT) que existía antes (d) y FRP ancestral (FRPpostHGT) que existía después del HGT (e) en diferentes relaciones molares como se indica a 20 ° C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos.

En conjunto, nuestros resultados muestran que la mayoría de los FRPL no pueden funcionar como reguladores alostéricos de OCP1, pero que un pequeño subgrupo de ellos adquirió fortuitamente esta capacidad. Como esto ocurrió en un genoma que no contenía OCP, esta capacidad es totalmente accidental y no puede haber sido el resultado de una selección natural directa. En principio, esto habría permitido que la proteína funcionara en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias, que no tiene ninguna relación, en el momento en que se transfirió por primera vez a sus genomas.

Dado que algunos FRPL parecen estar preparados para la interacción con OCP incluso antes de entrar en las cianobacterias, razonamos que la interfaz para su interacción también puede estar presente en AncOCPall, incluso si la conexión alostérica para acelerar la fotorrecuperación aún no hubiera evolucionado por completo. La cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC) de formas rojas fotoactivadas de AncOCPall (AncOCPallR) incubadas con FRP existente mostró un mayor tamaño en relación con AncOCPallR solo (Fig. 4a), lo que indica que FRP ya se une a AncOCPallR. Preguntamos si podíamos desencadenar la respuesta alostérica agregando FRP en exceso a la reacción de recuperación de OCPR a OCPO, y repetimos nuestros experimentos iniciales (Fig. 1d), pero esta vez usando una proporción molar mucho mayor de FRP en relación con OCP. Para nuestra sorpresa, en lugar de una aceleración, el tiempo de recuperación aumentó drásticamente de 166 ± 10 a 288 ± 10 s y 609 ± 5 s, utilizando una cantidad equimolar (de OCP a FRP) y un exceso molar cinco veces mayor de FRP, respectivamente (Fig. 4b). Esta desaceleración también apareció en AncOCP1 y 2, y si se agrega cualquiera de los FRP ancestrales o FRPL ancestrales (Fig. 4c y Datos extendidos Fig. 4u – x). Para descartar que esta desaceleración solo sea causada por efectos estéricos o apiñamiento molecular, repetimos los experimentos con PbFRPL (que prácticamente no tiene ningún efecto sobre el tiempo de recuperación de OCP1, incluso si se agrega en exceso molar: Fig. 3a), y también encontramos prácticamente ningún efecto en la recuperación de AncOCPall (Datos extendidos Fig. 4y).

a, SEC analítica de los complejos AncOCPall y AncOCPall-FRP con (OCPR) o sin iluminación de luz azul constante (OCPO) durante la cromatografía. b, c, Recuperación de la fotoconversión de AncOCPall con diferentes proporciones molares de FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) (b) o FRPpostHGT (c) a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos. Los datos para 'sin FRP' y '5:1 FRP' en b se toman de la Fig. 1d para comparar. d, modelo AlphaFold2 de la interacción entre FRP (cian) y el CTD de SYNY3 OCP1 (verde). e, zoom girado (del área enmarcada en negro en d) en la interfaz de enlace, con AncOCPall (en trigo) superpuesto a OCP1. Los aminoácidos implicados en la unión están etiquetados. Los sitios conservados en ambos OCP están en negro. Nitrógeno en azul y oxígeno en rojo. Los números de residuos siguen a SYNY3 OCP1. El inserto muestra el PP de los aminoácidos indicados en la interfaz de unión de la proteína AncOCPall reconstruida. f, PÁGINA nativa de OCPO ancestral sin iluminación (izquierda) y OCPR durante la iluminación constante con luz azul (derecha) muestran sus estados oligoméricos. La comparación con OCP1 (refs. 29,58) indica interfaces de dimerización conservadas que difieren entre OCPO y OCPR. Se utilizaron como marcadores moleculares un mutante de OCP (70 kDa) y el CTD de OCP1 (29 kDa), que forman dímeros independientes de la iluminación. Los experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares.

Por lo tanto, la unión de FRP por sí sola no es suficiente para que se produzca el efecto alostérico acelerador. En cambio, impide la fotorrecuperación de AncOCPall con un alto exceso molar de FRP. Una unión débil repetitiva o un FRP que no se disocia en la escala de tiempo adecuada podrían interrumpir o retrasar el proceso de recuperación de AncOCPall. Además, es posible que sea necesario ajustar aún más las características estructurales en el lado de OCP, como el bucle conector flexible entre el dominio N-terminal y CTD o la extensión N-terminal corta, para que la respuesta alostérica compleja y altamente eficiente del OCP1 existente tome lugar16,26.

Nuestros experimentos muestran que el LCA de todos los OCP ya tenía una capacidad latente para interactuar con FRP, aunque esta interacción aún no era capaz de acelerar la recuperación. Esto implica que al menos este potencial de interacción entre OCP y FRP evolucionó puramente por casualidad, incluso antes de que estas proteínas se encontraran por primera vez en una cianobacteria ancestral.

Para comprender la base estructural de esta afinidad latente, inferimos un modelo AlphaFold2 (ref. 28) del complejo OCP1-FRP. Predijo con confianza una interacción entre el CTD de OCP1 y FRP (Fig. 4d y Datos ampliados Fig. 9a, f) que es consistente con datos anteriores de dispersión de rayos X de ángulo pequeño27. La interacción explota la misma superficie hidrófoba que utiliza OCP1 para dimerizarse en su estado rojo en el ficobilisoma29. Se ha teorizado que el FRP favorece la separación de OCP1R del ficobilisoma al reducir la constante de asociación de unión y acelerar la recuperación al competir con esta interfaz del dímero en OCP1 (ref. 27). Los residuos y cargas que se muestran importantes para esta interfaz de dímero también están presentes en nuestros OCP ancestrales (Datos extendidos, Fig. 3a), lo que podría explicar por qué FRP ya puede interactuar con AncOCPall. Probamos esta hipótesis de dos maneras: primero, inferimos un modelo AlphaFold2 del CTD de AncOCPall y comparamos sus superficies con el CTD de OCP1. AncOCPall posee la misma superficie hidrofóbica que OCP1 con prácticamente todos los sitios de interfaz o cargas idénticas entre las dos proteínas. AlphaFold2 además predice una interacción entre esta superficie en AncOCPall y FRP (Fig. 4e y Datos extendidos Fig. 9b – e, g). En segundo lugar, este modelo indica además que la dimerización en el estado rojo debería ser una característica ancestral de todos los OCP. Para probar esto, utilizamos Native PAGE para comprender si nuestros OCP ancestrales también se dimerizan en su forma roja activada. De acuerdo con nuestra predicción, la activación conduce a la formación de complejos de tamaño consistente con los homodímeros en AncOCPallR y AncOCP1R. No detectamos dímeros rojos en AncOCP1 y 2, probablemente debido a su tiempo de recuperación extremadamente rápido que técnicamente impide mantener la forma roja en el gel (Fig. 4f).

En conjunto, esto indica que la superficie de unión explotada por el FRP es una antigua interfaz dímera de la forma roja de OCP que ya estaba presente en el LCA de todos los OCP, incluso antes de que el FRP fuera reclutado en el sistema cianobacteriano.

Los parálogos de OCPx ya no se ven afectados por FRP16,30. Para identificar los cambios estructurales subyacentes entre AncOCPall y OCPx, repetimos las predicciones de interacción con el CTD de un OCPx existente de Gloeobacter kilaueensis JS1. AlphaFold2 no predijo la interfaz de interacción entre FRP y este OCPx a menos que cambiáramos una serina conservada en la interfaz potencial a la tirosina ancestral de AncOCPall (Datos extendidos Fig. 9h, i). Esto sugiere que las proteínas OCP entraron y salieron del estado estructural que permite la interacción con FRP.

Para comprender las causas estructurales de por qué solo algunos FRPL aceleran la recuperación de OCP1 de la fotoconversión, finalmente comparamos las secuencias de diferentes FRPL. En nuestro modelo AlphaFold2, fenilalanina 76, lisina 102 y leucina 106 en FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 están en contacto con OCP1. La mayoría de los FRPL no tienen los tres estados juntos, pero ocasionalmente tienen uno o dos de estos estados. P. borbori FRPL, por ejemplo, tiene fenilalanina, pero presenta una tirosina en la posición 102 y una serina en la posición 106 (Datos ampliados, figura 8a). Otros FRPL tienen lisina, pero carecen de fenilalanina o leucina. Esto muestra que los estados importantes para la interacción con OCP1 individualmente van y vienen a lo largo de la filogenia FRPL. Los tres estados solo aparecieron juntos en FRPL a lo largo del linaje hacia las proteobacterias delta y las cianobacterias. Es notable que la TGH en cianobacterias haya ocurrido exactamente en esta estrecha ventana de total compatibilidad.

Aquí, hemos reconstruido la evolución de una interacción alostérica en el sistema de fotoprotección de las cianobacterias. Junto con trabajos previos sobre la evolución inicial de OCP13,16, la imagen que emerge es un ejemplo notable de retoques evolutivos:31 Los OCP probablemente fueron creados por un evento de fusión genética que no requería nada más que un conector flexible para crear una proteína fotoconmutable. de dos componentes no conmutables16. La adquisición horizontal de FRP luego introdujo un nuevo componente que podría acelerar alostéricamente la recuperación del estado fundamental en OCP1 sin ninguna modificación adicional. La creación del sistema OCP1-FRP completamente funcional solo requirió sustituciones en OCP que convirtieron una interacción inicialmente improductiva con el CTD en una que resulta en una aceleración de la recuperación de la foto (Fig. 5). Debido a que no podemos cronometrar la adquisición de FRP con precisión en relación con nuestros antepasados ​​OCP, no sabemos si estas sustituciones ocurrieron antes o después de la adquisición de FRP. Si hubieran sucedido antes, la interacción regulatoria entre OCP1 y FRP habría sido completamente funcional en el momento en que FRP se adquirió horizontalmente. Otra función conocida de FRP es la facilitación de la separación de OCP1 del ficobilisoma al cambiar la constante de equilibrio de unión OCPR-ficobilisoma15. Aunque este aspecto no fue analizado en nuestro estudio, imaginamos que la unión competitiva de FRP a un dímero OCPR ancestral también podría facilitar el desprendimiento del ficobilisoma o al menos impedir la unión a él, generando de hecho un posible modo ancestral de regulación que también podría haber sido funcional desde el momento en que el FRP apareció por primera vez en las cianobacterias.

El primer OCP fotoconmutable que sufre un cambio conformacional de un estado naranja cerrado a un estado rojo abierto con una alta irradiación de luz se formó en un evento de fusión de un HCP ancestral (AncHCP) y un homólogo ancestral similar a CTD (AncCTDH) mediante la adición de un enlazador16. . Una proteína similar a FRP (FRPL) se transfirió horizontalmente (HGT) al sistema de cianobacterias no relacionadas después de que una interfaz de unión latente para OCP ancestrales ya hubiera evolucionado por casualidad. FRP ahora explota la interfaz de dimerización CTD conservada de OCPR para acelerar fuertemente la recuperación de OCP1 de la fotoconversión. La estructura OCP utilizada aquí solo con fines ilustrativos es PDB ID 3MG1 (ref. 58).

Una pregunta que queda es ¿por qué se reclutó FRP en el sistema de fotoprotección de cianobacterias? Los OCP que existían antes de que se reclutara a FRP podían recuperarse rápidamente por sí solos. ¿Por qué complicar este sistema funcional? Somos conscientes de dos beneficios adaptativos postulados: primero, la interacción OCP1-FRP puede ofrecer un control más sofisticado del uso de energía en regímenes de luz que cambian rápidamente en la célula cianobacteriana13. Los sistemas de fotoprotección mediados por OCP sin FRP solo pueden regularse a nivel de transcripciones de ARN mensajero, que actúan lentamente al regresar de condiciones de luz estresantes a condiciones de luz normales, mientras que el control por FRP permite una regulación postraduccional potencialmente más rápida32. En segundo lugar, puede ofrecer una fotoprotección superior en condiciones de mucha luz: los parálogos de OCP2 y OCPx se recuperan tan rápido que tienen dificultades para acumular de forma estable la forma roja a temperatura ambiente13. El estado rojo más estable de OCP1 puede ser útil cuando se necesitan grandes cantidades de OCPR activo, pero esta alta estabilidad puede producirse a expensas de no poder recuperarse por sí solo. En este escenario, el reclutamiento de FRP habría permitido la evolución de un mecanismo de fotoprotección en última instancia más eficiente. Sin embargo, la interacción también podría ser un ejemplo de complejidad no adaptativa que simplemente se volvió difícil de perder33: la adquisición de FRP puede haber permitido a OCP1 "olvidar" cómo recuperarse eficientemente por sí solo. Una vez que hubiera perdido esta capacidad, el FRP se habría vuelto esencial para el funcionamiento completo de OCP1.

La compatibilidad específica del FRPL de la especie Desulfobacteraceae con los OCP de cianobacterias es completamente accidental, porque esta proteína evolucionó en un genoma que no contiene OCP. Esto demuestra que las superficies proteicas altamente complementarias pueden evolucionar completamente por casualidad y que estas interacciones inicialmente accidentales pueden incorporarse a la biología de los organismos. Por lo tanto, nuestro trabajo plantea la posibilidad de que algunas o incluso muchas interacciones proteína-proteína se creen inicialmente sin la acción de la selección natural directa. De hecho, los organismos pueden ser bombardeados con interacciones prácticamente completas que se crean cuando la transferencia horizontal, los cambios en la localización celular o los patrones de expresión espaciotemporal reúnen proteínas con superficies fortuitamente compatibles. De este fondo, la selección natural purgaría los que son dañinos, arreglaría los que son útiles e ignoraría los que son inofensivos.

Para inferir el árbol filogenético de las proteínas OCP de cianobacterias, utilizamos el conjunto de datos de OCP de Muzzopappa et al.16, y alineamos el perfil de las secuencias de aminoácidos correspondientes de los tres tipos de OCP descritos allí (OCP1, OCP2, OCPx), usando MUSCLE (v .3.8.31)34. Agregamos secuencias de proteínas homólogas similares a CTD de cianobacterias (CTDH) o HCP de cianobacterias como el grupo externo respectivo. Las alineaciones se corrigieron manualmente, se eliminaron los sitios correspondientes a inserciones específicas de linaje y las secuencias duplicadas. Las alineaciones completas se encuentran en los Datos complementarios 1. Utilizamos RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) 35 en el modo PROTGAMMAAUTO para identificar el modelo de evolución de aminoácidos que mejor se ajusta, que fue la matriz de sustitución revisada de Jones-Taylor-Thornton (JTTDCMut )36 con frecuencias base empíricas y distribución gamma de variación de tasa entre sitios. Usamos PhyML (v.3.1) 37 con movimientos SPR para inferir dos filogenias de ML con secuencias CTDH o HCP incluidas, y enraizamos los árboles entre cualquiera de esas secuencias y todas las secuencias OCP en nuestros árboles. Las dos filogenias muestran básicamente la misma topología, pero el grado A no asignado es el primero en ramificarse en el árbol de exogrupos de HCP (Datos ampliados, figura 2). Como las Gloeobacterias, que se sabe que son cianobacterias de ramificación temprana18,19,20,21, solo presentan OCPx, pero no homólogos de OCP de los grados no asignados, utilizamos el árbol de grupos externos CTDH para análisis adicionales (Datos ampliados, figura 1). La solidez de cada topología se probó ejecutando 100 bootstraps no paramétricos y, además, calculando estadísticas de aLRT con PhyML. Las secuencias ancestrales de OCP se reconstruyeron en el nodo interno del árbol de grupos externos CTDH, como se indica en la Fig. 1b y en la Fig. 1 de datos extendidos, utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9) 38 con el modelo de sustitución JTTDCMut y 16 categorías gamma. Las secuencias ancestrales se recortaron siguiendo reglas de parsimonia y contienen los estados con las probabilidades posteriores (PP) más altas en todos los sitios seleccionados. Los valores promedio de PP para todas las proteínas reconstruidas se encuentran en los datos ampliados, figura 3b-e. Las secuencias alternativas 'altAll' para cada ancestro reconstruido comprenden el estado con el segundo PP más alto si ese estado tiene PP > 0,20, y el estado ML en caso contrario.

Para el árbol filogenético de FRP (L) (Fig. 2a), recopilamos secuencias de aminoácidos utilizando BLASTP39 en línea el 23 de febrero de 2022, y la secuencia de aminoácidos de FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) como consulta. Para encontrar específicamente secuencias de FRPL, excluimos las cianobacterias (taxid:1117) y repetimos la búsqueda contra SYNY3 FRP y posteriormente contra P. borbori FRPL o buscamos explícitamente en grupos taxonómicos distintos de las cianobacterias. Además, agregamos secuencias metagenómicas del Catálogo Global de Genes Microbianos (GMGC, v.1.0)40. Las secuencias se alinearon con MUSCLE (v.3.8.31). La alineación se corrigió manualmente, se eliminaron los sitios correspondientes a inserciones específicas de linaje y las secuencias duplicadas. La alineación completa se encuentra en los Datos complementarios 1. Utilizamos RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) en el modo PROTGAMMAAUTO usando el criterio de información de Akaike para identificar el modelo de evolución de aminoácidos que mejor se ajusta, que era la matriz de sustitución de Le-Gascuel41 con frecuencias base fijas y distribución gamma de variación de tasa entre sitios. Inferimos la filogenia de ML y probamos la solidez de la topología ejecutando 100 bootstraps no paramétricos. Los TBE se calcularon con la herramienta web BOOSTER42. Además, las estadísticas de aLRT se calcularon con PhyML (v.3.1). El árbol tenía sus raíces entre acidobacterias y proteobacterias en el grupo FRPL y sugiere un HGT de una delta-proteobacteria ancestral a una cianobacteria ancestral. El árbol completo se encuentra en la figura complementaria 1. Las secuencias ancestrales de FRPL y FRP ancestral (FRPLpreHGT y FRPpostHGT, respectivamente) se reconstruyeron en los nodos internos del árbol utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9) con Le- Modelo de matriz de sustitución de Gascuel (LG) y 16 categorías gamma. Las brechas se asignaron usando parsimonia. Para los ancestros que resucitamos, elegimos el estado de aminoácidos con el PP más alto en cada sitio. El PP promedio para las proteínas reconstruidas se encuentra en los datos ampliados, figura 8b, c.

Para la reconciliación del árbol de genes y de especies, identificamos todas las secuencias en nuestro árbol FRP(L) que ciertamente podrían asignarse a una cepa bacteriana distinta que también está depositada en la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB)43 con su conjunto de 120 copias únicas. secuencias de proteínas marcadoras, utilizando BLASTP39. Con estas secuencias de aminoácidos concatenadas y alineadas, inferimos un árbol filogenético de ML usando IQ-Tree 2 (v.2.2)44 (-m LG, -b 100, -alrt 1000) y enraizado con acidobacterias como se describió anteriormente. En consecuencia, inferimos un árbol genético con secuencias FRP y FRPL de las especies correspondientes y ejecutamos 100 bootstraps no paramétricos para este subconjunto. La conciliación se realizó utilizando la estimación de ML con ALEml_undated en ALE45 y la filogenia de especies enraizadas, así como los árboles de arranque FRP (L) como entrada. Los árboles conciliados y la salida ALE se depositan en los datos de origen.

Para reconstruir las secuencias FRPL ancestral alternativa y FRP ancestral alternativa (altFRPLpreHGT y altFRPpostHGT, respectivamente), utilizamos una alineación inicial con menos secuencias en total. La alineación completa se encuentra en los Datos complementarios 1. Se infirió un árbol filogenético de ML con 100 bootstraps no paramétricos, y las secuencias ancestrales alternativas de FRPL y FRP ancestral alternativa se reconstruyeron en consecuencia en el nodo interno de ese árbol, como se muestra en la Figura 8e de Datos ampliados. y Figura complementaria 2, utilizando la reconstrucción marginal en el módulo CodeML de PAML (v.4.9) con el modelo de sustitución de matriz de sustitución de Le-Gascuel y 16 categorías gamma. Los TBE se calcularon con la herramienta web BOOSTER. Se recortaron secuencias ancestrales alternativas siguiendo reglas de parsimonia y contienen los estados con el PP más alto en todos los lados seleccionados. El PP promedio para las proteínas reconstruidas se encuentra en los datos ampliados, figura 8f, g.

Para el árbol de especies filogenéticas de cianobacterias que contienen OCP, identificamos todas las secuencias en nuestro árbol de OCP que ciertamente podrían asignarse a una cepa de cianobacteria distinta que también está depositada en la GTDB con su conjunto de 120 secuencias de proteínas marcadoras de copia única. Como grupo externo, agregamos conjuntos de secuencias de malainabacterias estrechamente relacionadas, así como conjuntos de especies de Chloroflexota más lejanamente relacionadas. Usamos estas secuencias de aminoácidos concatenadas, las alineamos e inferimos un árbol filogenético usando RaxmlHPC-AVX (v.8.2.10) en el modo PROTGAMMAAUTO, usando el criterio de información de Akaike para identificar el modelo de evolución de aminoácidos que mejor se ajusta, que fue la matriz de sustitución de Le-Gascuel41 con frecuencias base empíricas y distribución gamma de variación de tasas entre sitios. Inferimos la filogenia de ML y probamos la solidez de la topología ejecutando 100 bootstraps no paramétricos. Arraigamos el árbol entre las cianobacterias y el grupo externo, y mapeamos la aparición de los genes frp y ocp en los genomas correspondientes, sobre la base de las coincidencias de BLASTP y tBLASTn39, al lado del árbol (Datos ampliados, figura 6). La asignación de secuencias de OCP particulares a un grupo de parálogo de OCP se basa en la posición de sus secuencias de aminoácidos traducidas en nuestro árbol de OCP (Datos ampliados, figura 1).

Secuencias de ADN de OCP ancestrales, OCP1 existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) y FRP (SYNY3) se optimizaron con codones para su expresión en E. coli y se sintetizaron mediante Genscript Biotech o Life Technologies (GeneArt). Las construcciones sintetizadas estaban flanqueadas por sitios de escisión BamHI y NotI para la clonación en un vector pRSFDuet-1 modificado (Merck Millipore), que codifica un sitio de escisión de proteasa 3 C del rinovirus humano específico (HRV) (LEVLFQ/GP) y una etiqueta 6xHis en el extremo N. terminal (plásmido resultante denominado pRSFDuetM). Después de la escisión, todas las construcciones comenzaron con GPDPATM. Para la expresión de la FRP existente (gen SYNY3 slr1964), el vector pRSFDuetM-FRP se transformó en E. coli BL21 (DE3) (New England Biolabs), que se cultivaron durante la noche a 37 °C en medio Luria-Bertani (LB) (1 % triptona, 1% NaCl, 0,5% extracto de levadura, pH 7,0), suplementado con kanamicina (Kan, 50 µg ml-1). Al día siguiente, se inoculó 1 l de LB + Kan con 10 ml de cultivo nocturno y se incubó a 37 °C hasta una densidad óptica (OD600 nm) de 0,6 a 0,8, luego se indujo con isopropil-β-d-tiogalactopiranósido 0,5 mM ( IPTG) y se cultivaron en una incubadora con agitación durante 24 h a 30 °C. Las células se reunieron a 10.000 g durante 10 minutos y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la expresión de OCP (OCP1 existente, gen SYNY3 slr1963 y OCP ancestrales), las construcciones pRSFDuetM-OCPxx correspondientes se transformaron en E. coli BL21 (DE3) productora de equinenona, que alberga un plásmido p25crtO. Las expresiones se realizaron en 1 l de LB, suplementado con cloranfenicol (34 µg ml-1) y Kan (50 µg ml-1), al que se le inocularon 10 ml de cultivo nocturno, y se cultivó en una incubadora con agitación a 37°. C hasta OD600nm = 0,6–0,8. Después de la inducción con IPTG 0,5 mM, las células se incubaron a 25 °C durante 72 h y finalmente se recogieron a 10.000 g durante 10 min y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, fosfato 12 mM, pH 7,4), suplementados con 100 mg de lisozima (Ovobest) e inhibidor de proteasa (benzamidina 1 mM, ácido ε-amino-caproico 1 mM). La lisis celular se realizó utilizando una FrenchPress (G. Heinemann) en tres ciclos a 18.000 psi. Posteriormente, los restos celulares se sedimentaron a 18.000 g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se cargó en una columna de crudo Co2+-HiTrap Talon (Cytiva) de 5 ml usando una bomba peristáltica. La elución se llevó a cabo con tampón que contenía imidazol (1x PBS + imidazol 350 mM, pH 7,4), suplementado con proteasa HRV 3C en una relación de masa total de 500:1 (proteína a proteasa) y se dializó a 4 °C en proteasa 3C. tampón (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, ditiotreitol 2 mM, pH 8,5) durante 18 h. La solución de proteína se volvió a cargar en una columna de crudo Co2+-HiTrap Talon mientras que esta vez se recogía el flujo. En el caso de FRP, la purificación se realizó mediante SEC para el pulido, mientras que la purificación de OCP continuó con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para eliminar la apoproteína. Los flujos de OCP recogidos se dializaron durante la noche en tampón HIC ((NH4)2SO4 500 mM, urea 100 mM, fosfato 5 mM, pH 7,5) a 4 °C. HIC se realizó en una columna HiPrepTM 16/10 Phenyl HP (Cytiva) en un sistema automatizado Azura FPLC (Knauer). Las proteínas se eluyeron con un tampón hidrófilo (urea 100 mM, fosfato 5 mM, pH 7,5). Las fracciones de proteínas ricas en carotenoides se concentraron utilizando unidades de filtro centrífugo con corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa (Pall Corporation) para SEC. El FRP se concentró con unidades de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa. Luego, se cargaron 500 µl de cada solución de proteína concentrada en una columna SuperdexTM 200 Incremento 10/300 (Cytiva) y se eluyeron con 1X PBS. Las proteínas se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Las secuencias optimizadas con codones que codifican las proteínas FRPL, FRP ancestral y FRPL ancestral existentes se obtuvieron de Integrated DNA Technologies (IDT) o Twist Biosciences. Se clonaron en vectores pET-LIC que contenían una etiqueta 6xHis N- o C-terminal usando Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs). Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla complementaria 1. El ensamblaje correcto se verificó mediante secuenciación Sanger (Microsynth). Los plásmidos se transformaron en E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen). Para la sobreproducción de proteínas, se inocularon 50 ml de LB, suplementados con carbenicilina (Carb) (100 μg ml-1), con una única colonia de una placa LB + Carb nueva y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora con agitación. Se inocularon seis lotes de 500 ml de LB + Carb con cultivos nocturnos a OD600 nm = 0,01 y se cultivaron a OD600 nm = 0,6–0,8 durante aproximadamente 2,5 h. La sobreproducción de proteínas se indujo con IPTG 1 mM. Después de 4 h, las células se reunieron a 4392 g durante 20 minutos a 4 °C y los sedimentos celulares se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, las células se resuspendieron en 35 ml de tampón A (NaCl 300 mM, Tris 20 mM, imidazol 20 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, pH 8,0) y se añadió una tableta de cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche). Las células se rompieron dos veces en un microfluidizador LM10 (Microfluidics) a 13.000 psi. El lisado se eliminó mediante centrifugación a 29.930 g durante 30 minutos y se pasó a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm, luego se cargó en un cartucho IMAC cargado con Ni Bio-Scale Mini Nuvia de 5 ml (BioRad). Después de lavar con 25 ml de tampón A, la proteína se eluyó con un gradiente lineal sobre 20 ml de 0 a 100% de tampón B (NaCl 300 mM, Tris 20 mM, imidazol 500 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, pH 8,0) en un sistema NGC (BioRad). Las fracciones que contenían la proteína se verificaron en geles SDS al 15% fabricados internamente y se combinaron para SEC con una columna HiLoad 26/600 Superdex (Cytiva) en tampón SEC (NaCl 200 mM, KCl 20 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5). ) en un sistema NGC. La pureza de las fracciones que contenían la proteína se verificó en geles SDS al 15% fabricados internamente y se combinaron para su concentración a 2000 g con unidades de filtro centrífugas Amicon Ultra (Millipore) con un MWCO de 3 kDa. Las proteínas se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Para analizar el contenido de carotenoides de las holoproteínas OCP, se mezclaron 50 µl de solución de proteína concentrada con 1 ml de acetona y se centrifugaron a velocidad máxima a 4 °C para centrifugar la proteína precipitada. El sobrenadante amarillento se evaporó en un concentrador de vacío centrífugo (Eppendorf) a 30 °C hasta que la acetona se evaporó por completo y los carotenoides precipitaron como cristales rojos. Se eliminó la solución acuosa restante y los cristales de carotenoides rojos se redisolvieron en 50 µl de acetona. La solución rica en carotenoides se transfirió a un vial de muestra que se colocó en un sistema UFLC NexeraX2 (Shimadzu), equipado con una columna Accucore C30 (Thermo Fisher Scientific, 250 × 2,1 mm, tamaño de partícula de 2,6 µm, tamaño de poro de 150 Å). Como eluyentes de la fase móvil, se utilizaron el tampón A (metanol a agua, 95:5) y el tampón B (metanol a THF, 7:3) con el siguiente protocolo: 0–4,3 min 0% de tampón B, 4,3–8,6 min lineal gradiente de 0 a 100% de tampón B, 8,6–15,6 min 100% de tampón B, 15,6–20,1 min 0% de tampón B con un caudal constante de 0,4 ml min-1. Los carotenoides eluidos se verificaron mediante espectrometría de masas para correlacionar los tiempos de elución con especies de carotenoides específicas, así como mediante cromatografía en capa fina y comparación con muestras de referencia.

Los espectros de absorción se registraron con un espectrómetro Maya2000Pro (Ocean Optics), acoplado mediante una fibra a una fuente de luz de tungsteno de deuterio (Sarspec) y un soporte de cubeta (CVH100, Thorlabs). Para los análisis cinéticos de OCP/FRP, se conectó por fibra un soporte de cubeta con temperatura controlada con un dispositivo de agitación constante qpod2e (Quantum Northwest) a un espectrómetro CCS100/M (Thorlabs) y una fuente de luz de tungsteno SLS201L/M (Thorlabs). Para la iluminación con luz actínica se utilizó un diodo emisor de luz (Avonec) de 3 W con una emisión máxima a 455 nm. Se fotoconmutaron diferentes OCPO (mezclados con diferentes FRP existentes o ancestrales o FRPL existentes o ancestrales en varias proporciones molares, o solos) al estado rojo (OCPR) aplicando luz azul durante al menos 3 min y 30 s o hasta una meseta. Se alcanzó y la recuperación de la foto se siguió constantemente a 550 nm después de apagar la fuente de luz azul. Las constantes de tiempo de recuperación (τ) se determinaron ajustando curvas de relajación de OCPR a retroconversiones de OCPO con una función de caída monoexponencial y se calcularon las desviaciones estándar (sd) de tres réplicas independientes.

Se utilizó espectroscopia de dicroísmo circular ultravioleta lejano para evaluar la estructura secundaria de P. borbori FRPL (PbFRPL) producido de forma heteróloga en solución. La proteína se diluyó a una concentración de aproximadamente 50 µg ml-1 en tampón de dicroísmo circular (NaF 100 mM, Na2HPO4/NaH2PO4 10 mM, pH 7,5) y se midió en una cubeta de 0,1 cm a temperatura ambiente usando un JASCO J-810. espectropolarímetro (Jacso) en el rango de 190 a 240 nm en pasos de escaneo de 0,2 nm. Se registraron tres espectros sucesivos, se corrigieron los valores iniciales y se promediaron.

La muestra de proteína FRPL de P. borbori (PbFRPL) se almacenó a -20 °C antes de cambiar el tampón por acetato de amonio 200 mM (pH 6,8) mediante múltiples rondas de concentración y dilución utilizando concentradores de proteínas Pierce (Thermo Fisher). Luego, la muestra se diluyó a 4 µM (monómero) inmediatamente antes de las mediciones. Los datos se recopilaron utilizando capilares internos chapados en oro en un espectrómetro de masas Q Exactive (ThermoFisher Scientific), operado en modo de iones positivos con una temperatura de fuente de 100 °C y un voltaje capilar de 1,2 kV. La captura en la fuente se configuró en −100 V para ayudar con la disociación de pequeños aductos de iones. La óptica de transferencia de iones y los gradientes de voltaje en todos los instrumentos se optimizaron para una transmisión ideal. Los espectros se adquirieron con diez microescaneos para aumentar la relación señal-ruido con tiempos transitorios de 64 ms, correspondientes a la resolución de 17.500 a m/z = 200, y un objetivo de AGC de 1,0 × 106. El parámetro de umbral de ruido fue se estableció en tres y el rango de escaneo utilizado fue de 350 a 8000 m/z.

La cristalización de P. borbori FRPL (PbFRPL) se realizó mediante el método de gota colgante a 20 °C en gotas de 2 µl, que consistían en cantidades iguales de proteína y soluciones de precipitación. PbFRPL cristalizó a 119 µM en 20 días en Li2SO4 0,2 M, CHES 0,1 M, pH 9,5 y tartrato de sodio:potasio 1,4 M. Antes de la recopilación de datos, los cristales se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido sin el uso de crioprotectores. Los datos del sincrotrón se recolectaron en condiciones criogénicas en la línea de luz P13, operada por el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) de Hamburgo en el anillo de almacenamiento PETRA III (Deutsches Elektronen Synchrotron)46. Los datos se integraron y escalaron con XDS y se fusionaron con XSCALE47. Las estructuras se determinaron mediante reemplazo molecular con PHASER48, se construyeron manualmente en COOT49 y se refinaron con PHENIX50. Para la determinación de la estructura mediante reemplazo molecular, se utiliza la estructura cristalina del FRP de Synechocystis sp. Se utilizó PCC 6803 (PDB ID 4JDX, ref. 25) como modelo de búsqueda. La estructura final de PbFRPL se cargó en el RCSB PDB con el número de acceso 8AG8. Los datos se renderizaron y visualizaron con PyMol (v.2.4.0)51.

Después de varias rondas de cultivo, volvimos a secuenciar el genoma completo de P. borbori para descartar la pérdida del gen frpl en el cultivo (una posible explicación de la ausencia de FRPL en todos los organismos modelo), la localización del plásmido (que podría facilitar la HGT) o la contaminación de la muestra. , pero descubrió que el genoma era un cromosoma circular único de 5,34 MB de tamaño, lo que implica una copia del gen frpl, pero ningún homólogo de OCP, HCP o CTDH (Datos ampliados, figura 7d). El ADN genómico de P. borbori en fase estacionaria se obtuvo utilizando el kit NucleoBond HMW DNA (Macherey-Nagel) según las directrices del fabricante, y utilizando lisozima para la lisis celular (concentración final 1 mg ml-1) durante 1 h a 37 °C en 2 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. La calidad y la concentración del ADN se evaluaron mediante un espectrofotómetro NanoDrop 8000 y un fluorómetro Qubit 3 utilizando reactivos BR de ADN de doble cadena. La preparación de la biblioteca se realizó utilizando el kit de secuenciación de ligadura SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies), de acuerdo con las pautas del fabricante, excepto que el ADN de entrada se incrementó cinco veces para que coincida con la molaridad esperada en el protocolo ya que no se aplicó corte de ADN. La secuenciación se realizó en un dispositivo MinION Mk1B durante 24 h utilizando una 'Celda de flujo Flongle' (FLO-FLG001, química celular R9.4.1). Los datos de nanoporos se llamaron con el software de llamada de base ONT Guppy. Se ensamblaron lecturas largas utilizando canu52, lo que dio como resultado un único cromosoma circular. Las lecturas sin procesar se depositan en el Archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y se puede acceder a ellas bajo BioProject no. PRJNA865569 y número de acceso de BioSample. SAMN30120905.

La tinción tipo DSM17834 de la delta-proteobacterium P. borbori se adquirió de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania). Se cultivó aeróbicamente en medio PME (0,5% peptona, 0,3% extracto de carne, pH 7,0) a 28 °C y se registró una curva de crecimiento de triplicados biológicos. El tiempo de generación (G) durante el crecimiento exponencial se estimó usando la fórmula \(G = \frac{{{{\Delta }}t}}{{3.3\log \left( {\frac{{{\mathrm{OD} }_2}}{{{\mathrm{OD}}_1}}} \right)}}\).

Se generaron fusiones de proteínas para la localización in vivo con microscopía de epifluorescencia mediante amplificación por PCR del gen frpl de P. borbori, incluidos 200 pb de la región 5' no traducida y la inserción en vectores pSG1164 con una secuencia codificante de mVenus N o C-terminal y una secuencia del enlazador 'GGGGGSL' en el cuadro usando Gibson Assembly Master Mix (NEB). El montaje correcto fue verificado mediante Sanger Sequencing (Microsynth). Se preparó P. borbori químicamente competente mediante la modificación de un protocolo de Irani y John53, desarrollado inicialmente para P. aeruginosa, de la siguiente manera: el medio se cambió a PME y las temperaturas se redujeron a 28 °C. Los plásmidos se transformaron en P. borbori siguiendo el protocolo de transformación de Irani y John53, pero cambiando la temperatura de choque térmico a 30 °C, el medio a PME, la temperatura de crecimiento a 28 °C y la concentración de carbenicilina a 100 µg ml-1. Las placas se incubaron a 28 °C durante 48 h hasta que las colonias fueron visibles.

Para la microscopía de epifluorescencia, se cultivaron células de P. borbori a 28 °C y 200 rpm hasta una DO600 = 0,6 para "crecimiento exponencial" y durante 2 días hasta una DO600 de alrededor de 1,0 para condiciones de "inanición" en medios PME. Las células se fijaron sobre almohadillas de agarosa al 1% intercalando 100 µl de agarosa derretida entre dos cubreobjetos (12 mm, Menzel). Luego se agregaron 3 µl del cultivo a un cubreobjetos redondo (25 mm; Marienfeld) y se fijaron con una almohadilla de agarosa. Para la adquisición de imágenes de campo amplio, se utilizó un microscopio Zeiss Observer A1 (Carl Zeiss) con un objetivo de inmersión en aceite (aumento de ×100, apertura numérica de 1,45, alfa Plan-FLUAR; Carl Zeiss) con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CoolSNAP EZ; Fotometría) y una iluminación fluorescente de halogenuros metálicos HXP 120 con control de intensidad. Para la microscopía de epifluorescencia, se utilizó un juego de filtros de proteína fluorescente verde (BrightLine 470/40, Beamsplitter 495 y Brightline 525/50). Las muestras se iluminaron durante 0,5 a 2 s en el plano medio de la celda. La fluorescencia integrada de células enteras se determinó por célula y se corrigió según la fluorescencia de fondo. La edición final de las imágenes se realizó en ImageJ2/FIJI (v.1.52)54,55.

La SEC analítica se realizó con una columna Superdex 75 Incremento 3.2/300 (Cytiva), equilibrada con 1× PBS a un caudal de 0,1 ml min-1 y un volumen total de inyección de muestra de 20 µl. Para medir con iluminación de luz azul, se montaron cuatro LED de 3 W (Avonec) con una emisión máxima de 455 nm en un disipador de calor de 20 cm a distancias constantes frente a la columna SEC para iluminar continuamente la muestra en la columna. La absorción se registró a 280, 496 y 550 nm para seguir los perfiles de elución.

Los modelos del complejo proteico AlphaFold2 se generaron utilizando el servidor ColabFold56 el 20 de mayo de 2022, utilizando como secuencias de entrada el CTD de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) o AncOCPall y FRP (SYNY3) con configuración predeterminada. Además, la estructura de AncOCPall completa se predijo por separado. El 3 de noviembre de 2022, repetimos el análisis con el CTD de OCPx de G. kilaueensis JS1 o un mutante S264Y (la serina en la posición 264 (numeración SYNY3) se cambió a tirosina) de ese OCPx con FRP (SYNY3). Las estructuras modeladas se depositan en los datos de origen. Los datos se renderizaron y visualizaron con PyMol (v.2.4.0)51.

La PAGE nativa se realizó en una Mini-Protean Tetra Cell (Biorad) utilizando geles de gradiente moldeados internamente con una concentración de acrilamida del 3 al 14% en un sistema tampón Tris-glicina sin SDS para obtener condiciones de proteína nativa. No se utilizó gel de apilamiento. La cámara de electroforesis se enfrió constantemente en un refrigerador y se iluminó con cuatro LED de 3 W (Avonec) con un máximo de emisión de 455 nm para fotoconmutar las proteínas OCP en gel. El voltaje se ajustó a 80 V constantemente durante 240 min y posteriormente a 120 V durante otros 100 min.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos originales están disponibles en el Repositorio Abierto de Datos de Investigación de la Sociedad Max Planck (Edmond) en https://doi.org/10.17617/3.44RHFZ. Los datos de cristalografía están disponibles en RCSB PDB con el número de acceso 8AG8. Los datos de secuenciación están disponibles en NCBI Sequence Read Archive en BioProject PRJNA865569.

Peracchi, A. & Mozzarelli, A. Exploración y explotación del alosterio: modelos, evolución y focalización de fármacos. Biochim. Biofísica. Acta 1814, 922–933 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dawkins, R. Escalada del Monte Improbable (Norton, 1996).

Pillai, AS et al. Origen de la complejidad en la evolución de la hemoglobina. Naturaleza 581, 480–485 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coyle, SM, Flores, J. & Lim, WA La explotación del alosterio latente permite la evolución de nuevos modos de regulación de la MAP quinasa. Celda 154, 875–887 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bridgham, JT, Carroll, SM y Thornton, JW Evolución de la complejidad del receptor hormonal mediante explotación molecular. Ciencia 312, 97-101 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pillai, AS, Hochberg, GKA y Thornton, JW Mecanismos simples para la evolución de la complejidad de las proteínas. Ciencia de las proteínas. 31, e4449 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Muzzopappa, F. & Kirilovsky, D. Cambio de color para fotoprotección: la proteína carotenoide naranja. Tendencias de ciencia vegetal. 25, 92-104 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Slonimskiy, YB, Maksimov, EG y Sluchanko, NN Proteína de recuperación de fluorescencia: un regulador de fotoprotección potente pero poco explorado en cianobacterias. Fotoquímica. Fotobiol. Ciencia. 19, 763–775 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kay Holt, T. & Krogmann, DW Una proteína carotenoide de cianobacterias. Biochim. Biofísica. Acta 637, 408–414 (1981).

Artículo de Google Scholar

Wilson, A. y col. Una proteína carotenoide soluble implicada en la disipación de energía relacionada con los ficobilisomas en las cianobacterias. Célula vegetal 18, 992–1007 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilson, A. y col. Una proteína carotenoide fotoactiva que actúa como sensor de intensidad de la luz. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 105, 12075–12080 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gwizdala, M., Wilson, A. y Kirilovsky, D. Reconstitución in vitro del mecanismo fotoprotector de cianobacterias mediado por la proteína carotenoide de naranja en Synechocystis PCC 6803. Plant Cell 23, 2631–2643 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bao, H. y col. Familias adicionales de proteínas carotenoides de naranja en el sistema fotoprotector de las cianobacterias. Nat. Plantas 3, 17089 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Boulay, C., Wilson, A., D'Haene, S. y Kirilovsky, D. Identificación de una proteína necesaria para la recuperación de la capacidad total de la antena en el mecanismo fotoprotector relacionado con OCP en cianobacterias. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 107, 11620–11625 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thurotte, A. y col. La proteína de recuperación de fluorescencia de las cianobacterias tiene dos actividades distintas: aminoácidos de la proteína carotenoide de naranja implicados en la interacción del FRP. Biochim. Biofísica. Acta, Bioenerg. 1858, 308–317 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Muzzopappa, F., Wilson, A. y Kirilovsky, D. Las interacciones entre dominios revelan la evolución molecular de la proteína carotenoide de naranja. Nat. Plantas 5, 1076–1086 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Melnicki, MR y cols. Estructura, diversidad y evolución de una nueva familia de proteínas solubles de unión a carotenoides en cianobacterias. Mol. Planta 9, 1379-1394 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schirrmeister, BE, Gugger, M. & Donoghue, PCJ Cianobacterias y el gran evento de oxidación: evidencia de genes y fósiles. Paleontología 58, 769–785 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Moya, A. et al. Impulsada por la evolución progresiva de la complejidad de la secuencia del genoma en cianobacterias. Ciencia. Rep. 10, 19073 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, KR y cols. Una filogenia ribosomal ampliada de cianobacterias respalda una ubicación profunda de plastidios. Frente. Microbiol. 10, 1612 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Rahmatpour, N. y col. Un nuevo aislado sin tilacoides llena un vacío de mil millones de años en la evolución de las cianobacterias. actual. Biol. 31, 2857–2867.e4 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kirilovsky, D. & Kerfeld, CA La proteína carotenoide naranja: una proteína fotoactiva de luz azul-verde. Fotoquímica. Fotobiol. Ciencia. 12, 1135-1143 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Coleman, GA y cols. Una filogenia arraigada resuelve la evolución bacteriana temprana. Ciencia 372, eabe0511 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vanparys, B., Heylen, K., Lebbe, L. y de Vos, P. Pseudomonas peli sp. nov. y Pseudomonas borbori sp. nov., aislado de un inóculo nitrificante. En t. J. Sistema. 56, 1875–1881 (2006).

CAS Google Académico

Sutter, M. y col. Estructura cristalina del FRP e identificación del sitio activo para la modulación de la fotoprotección mediada por OCP en cianobacterias. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, 10022–10027 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sluchanko, NN, Slonimskiy, YB, Moldenhauer, M., Friedrich, T. y Maksimov, EG La eliminación de la extensión N-terminal corta en OCP revela el sitio principal para la unión de FRP. FEBS Lett. 591, 1667–1676 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sluchanko, NN et al. Las topologías del complejo proteico OCP-FRP sugieren un mecanismo para controlar la alta tolerancia a la luz en las cianobacterias. Nat. Comunitario. 9, 3869 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Saltador, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Domínguez-Martín, MA et al. Estructuras de un ficobilisoma en estados fotoprotegidos y captadores de luz. Naturaleza 609, 835–845 (2022).

Slonimskiy, YB et al. Una proteína carotenoide de color naranja primordial: estructura, actividad de fotoconmutación y aspectos evolutivos. En t. J. Biol. Macromol. 222, 167–180 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jacob, F. Evolución y retoques. Ciencia 196, 1161-1166 (1977).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Petrescu, DI, Dilbeck, PL y Montgomery, BL Ajuste ambiental de homólogos del gen que codifica la proteína carotenoide de naranja en la cianobacteria Fremyella diplosiphon. Frente. Microbiol. 12, 819604 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Schulz, L., Sendker, FL y Hochberg, GKA Complejidad no adaptativa y función bioquímica. actual. Opinión. Estructura. Biol. 73, 102339 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Edgar, RC MUSCLE: alineación de secuencias múltiples con alta precisión y alto rendimiento. Ácidos nucleicos res. 32, 1792-1797 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stamatakis, A. RAxML versión 8: una herramienta para el análisis filogenético y el posanálisis de grandes filogenias. Bioinformática 30, 1312-1313 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kosiol, C. & Goldman, N. Diferentes versiones de la matriz de tipos de Dayhoff. Mol. Biol. Evolución. 22, 193-199 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Guindon, S. y col. Nuevos algoritmos y métodos para estimar filogenias de máxima verosimilitud: evaluación del rendimiento de PhyML 3.0. Sistema. Biol. 59, 307–321 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yang, Z. PAML 4: análisis filogenético por máxima verosimilitud. Mol. Biol. Evolución. 24, 1586-1591 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW y Lipman, DJ Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mende, DR et al. proGenomes2: una base de datos mejorada para anotaciones funcionales, taxonómicas y de hábitat precisas y consistentes de genomas procarióticos. Ácidos nucleicos res. 48, D621–D625 (2020).

CAS PubMed Google Académico

Le, SQ y Gascuel, O. Una matriz de reemplazo de aminoácidos general mejorada. Mol. Biol. Evolución. 25, 1307-1320 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lemoine, F. y col. Renovando el arranque filogenético de Felsenstein en la era del big data. Naturaleza 556, 452–456 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parques, DH et al. GTDB: un censo en curso de diversidad de bacterias y arqueas a través de una taxonomía filogenéticamente consistente, normalizada por rangos y basada en el genoma completo. Ácidos nucleicos res. 50, D785–D794 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Minh, BQ y cols. IQ-TREE 2: nuevos modelos y métodos eficientes para la inferencia filogenética en la era genómica. Mol. Biol. Evolución. 37, 1530-1534 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szöllősi, GJ, Rosikiewicz, W., Boussau, B., Tannier, E. & Daubin, V. Exploración eficiente del espacio de árboles genéticos reconciliados. Sistema. Biol. 62, 901–912 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Cianci, M. y col. P13, la línea de luz de cristalografía macromolecular EMBL en el anillo PETRA III de baja emitancia para fases de alta y baja energía con enfoque de haz variable. J. Sincrotrón Rad. 24, 323–332 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D.66, 125-132 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCoy, AJ y cols. Software cristalográfico Phaser. J. Aplica. Cristalogr. 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P. y Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D. 60, 2126–2132 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Adams, PD y cols. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. D. 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

El sistema de gráficos moleculares PyMOL v.2.4.0 (Schrödinger, LLC).

Koren, S. y col. Canu: ensamblaje de lectura larga escalable y preciso mediante ponderación k-mer adaptativa y separación repetida. Genoma Res. 27, 722–736 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irani, VR & Rowe, JJ Mejora de la transformación en Pseudomonas aeruginosa PAO1 por Mg2+ y calor. BioTécnicas 22, 54–56 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rueden, CT y cols. ImageJ2: ImageJ para la próxima generación de datos de imágenes científicas. Bioinformación de BMC. 18, 529 (2017).

Artículo de Google Scholar

Schindelin, J. y col. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mirdita, M. et al. ColabFold: hacer que el plegamiento de proteínas sea accesible para todos. Nat. Métodos 19, 679–682 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, L. y col. Conocimiento estructural del mecanismo de transferencia de energía en ficobilisomas de cianobacterias. Nat. Comunitario. 12, 5497 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilson, A. y col. Determinantes estructurales que subyacen a la fotoprotección en la proteína carotenoide fotoactiva de naranja de las cianobacterias. J. Biol. Química. 285, 18364–18375 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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NS, SGG y GKAH cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck. AARR y D.Schindler reciben financiación de la Sociedad Max Planck en el marco del proyecto MaxGENESYS. TF agradece la financiación de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvenciones nº FR 1276/5-1 y FR 1276/6-1) y la concesión de la Fundación Einstein para la máquina Azura FPLC. Cofinanciado por la Unión Europea (ERC, EVOCATION, 101040472). Sin embargo, los puntos de vista y opiniones expresados ​​son únicamente los de los autores y no reflejan necesariamente los de la Unión Europea o el Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad otorgante pueden ser considerados responsables de ellos. PLG agradece el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención n.º GR1670/27-1). JLPB y D.Saman. Reconocer con gratitud el apoyo del fideicomiso Leverhulme (subvención n.º RPG-2021-246). A los efectos del acceso abierto, JLPB ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a la versión del manuscrito aceptado por el autor que surge de este envío. Agradecemos a NN Tavraz (TU Berlín) y C.-N. Mais (Universidad de Marburg) por el apoyo de laboratorio.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Niklas Steube, Marcus Moldenhauer.

Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre, Marburg, Alemania

Niklas Steube, Adán A. Ramírez Rojas, Sriram G. Garg, Daniel Schindler y Georg KA Hochberg

Instituto de Química PC14, Universidad Técnica de Berlín, Berlín, Alemania

Marcus Moldenhauer y Thomas Friedrich

Departamento de Química, Universidad de Marburg, Marburg, Alemania

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Peter L. Graumann, Gert Bange y Georg KA Hochberg

Centro de Microbiología Sintética (SYNMIKRO), Marburg, Alemania

Paul Weiland, Alexandra Kilb, Daniel Schindler, Peter L. Graumann, Gert Bange y Georg KA Hochberg

Departamento de Química, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Saman y Justin LP Benesch

Instituto Kavli para el Descubrimiento de Nanociencias, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Saman y Justin LP Benesch

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NS, MM, TF y GKAH concibieron el proyecto y supervisaron la redacción del manuscrito. NS realizó filogenética, reconstrucción de secuencias ancestrales, purificación de proteínas, espectroscopia de dicroísmo circular y manipulación genética de P. borbori. MM realizó experimentos biofísicos y bioquímicos de purificación de proteínas. PW y GB realizaron cristalografía de proteínas e interpretaron los datos. AK y PLG realizaron microscopía de epifluorescencia e interpretaron los datos. D.Saman y JLPB realizaron espectrometría de masas nativa e interpretaron los datos. AARR y D.Schindler secuenciaron P. borbori y analizaron los datos. SGG infirió los árboles de especies filogenéticas y realizó la reconciliación árbol de genes-árbol de especies. NS, MM, TF y GKAH interpretaron todos los datos. Todos los autores contribuyeron a la redacción y discusión del manuscrito.

Correspondencia a Thomas Friedrich o Georg KA Hochberg.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Ecology & Evolution agradece a Per Jemth y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Filogenia ML de proteínas OCP con proteínas ancestrales reconstruidas (Anc) en nodos etiquetados y proteínas similares al dominio C-terminal de cianobacterias (CTDH) como grupo externo (insertar con contornos negros). Los parálogos y ancestros de OCP están codificados por colores como en la Fig. 1b. Además, probamos una secuencia más conservadora para el último ancestro común de OCP1 (conAncOCP1, en gris) (Datos extendidos Fig. 3a+e, 4d,h,l,p,t), así como ancestros alternativos 'altAll' para cada nodo. en este árbol (Datos ampliados, figuras 3a, 5a-l). Los números en cursiva son probabilidades de arranque de Felsenstein (FBP) de 100 réplicas. Los números grises son valores aproximados de la prueba de razón de verosimilitud (aLRT). La longitud de las ramas representa sustituciones promedio por sitio. Insertar con contornos grises es un zoom triple para mostrar correctamente la topología de la rama en esa área. Alineación de secuencias múltiples subyacente en Datos complementarios 1.

Filogenia ML de las proteínas OCP como en la figura 1 de datos ampliados, pero con proteínas carotenoides helicoidales de cianobacterias (HCP, inserto) como grupo externo. Alineamiento de secuencias múltiples subyacente en Datos complementarios 1. Aquí no se reconstruyeron ancestros.

a, Alineamiento de secuencias múltiples de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con secuencias OCP ancestrales reconstruidas y respectivas secuencias alternativas (alt). Se indican los estados importantes para la dimerización de OCP1O16, OCP1R29, la desaceleración de OCP1 y la interacción con FRP7, y en rojo si se conserva o en azul si no. La numeración de residuos sigue SYNY3 OCP1. Las regiones del dominio C-terminal (CTD), del enlazador y del dominio N-terminal (NTD) se marcan en consecuencia. El OCP1 ancestral más conservador (conAncOCP1) y su secuencia alternativa que no aparecen en el texto principal están atenuados. ser, Distribución de probabilidades posteriores (pp) por sitio con 20 categorías de bin por secuencia reconstruida con la media y el número de sitios ambiguos mostrados. Los sitios se consideraron ambiguos si pp > 0,2 para el estado con el segundo pp más alto y fueron reemplazados por aquellos estados en los ancestros alternativos.

ad, geles de poliacrilamida SDS al 12 % de purificaciones de proteínas ancestrales. l, lisado. pies, flujo a través. w, lavar. e, elución. -el suyo, después del escote de su etiqueta. sí, después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. eh, espectros de absorción UV-Vis del estado naranja inactivo y rojo activo de OCP ancestrales. ip, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales con (en proporciones molares de 5 OCP a 1 FRP) o sin FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) como se indica a diferentes temperaturas. qt, gráficos de Arrhenius de recuperación de la fotoconversión con (rojo) o sin SYNY3 FRP (negro). uy, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales, ya sea solos o con diferentes FRP ancestrales o FRPL ancestrales o FRPL existentes de Pseudomonas borbori en diferentes proporciones molares como se indica a 20 ° C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos.

ad, geles de poliacrilamida SDS al 12 % de purificaciones de proteínas ancestrales alternativas. l, lisado. pies, flujo a través. w, lavar. e, elución. -el suyo, después del escote de su etiqueta. sí, después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. eh, espectros de absorción UV-Vis del estado naranja inactivo y rojo activo de OCP ancestrales alternativos. il, Recuperación de la fotoconversión de OCP ancestrales alternativos con (cian) o sin (negro) FRP existente de Synechocystis sp. PCC 6803 a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos; altAncOCPall apenas se puede cambiar de foto.

Filogenia de especies de ML con probabilidades Bootstrap de Felsenstein (FBP) de 100 réplicas en cursiva. La aparición de los parálogos de FRP y OCP se mapea junto a la filogenia. Los asteriscos indican entradas de múltiples especies en la base de datos BLAST39. El signo de exclamación marca la única cepa que carece de FRP y tiene OCP1. Alineación de la secuencia de aminoácidos subyacente en Datos complementarios 1.

a, h + i, geles de poliacrilamida SDS al 15 % de P. borbori, Methlocaldum sp., Desulfobacteriaceae (D) y Chlorobi sp. (C) FRPL después de la cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. b, Espectros de dicroísmo circular (CD) de P. borbori FRPL (negro) en tampón CD (gris). c, Datos de espectrometría de masas nativa de P. borbori FRPL. d, Estadísticas de secuenciación de nanoporos. e, Curva de crecimiento de P. borbori por triplicado biológico con medias y desviación estándar (DE) mostradas, y determinación del tiempo de generación (G) durante el crecimiento exponencial. f, Microscopía de epifluorescencia de cepas de P. borbori que no expresan ninguna (WT), solo mVenus (mVenus) o proteínas de fusión FRPL con fusión de mVenus N o C-terminal. Se muestra la fluorescencia integrada de células completas con la media y la SD, la imagen de campo claro (BF), la señal del canal GFP (mVenus) y una superposición de ambas (fusión). Las flechas rojas apuntan a focos de señal en los polos de las células. La barra de escala representa 2 μm y es aplicable a todas las imágenes. g, Se realizaron pruebas t de Welch bilaterales para comparar la fluorescencia integrada media de células enteras con *** p < 0,001, ** p = 0,013, ns, no significativo (p = 0,580); n = 28 celdas por condición. Los cuadros se extienden desde los valores intercuartiles inferiores a los superiores de los datos, con una línea en la mediana. Los bigotes muestran datos dentro de rangos intercuartílicos de ± 1,5. Los círculos son valores atípicos. j + k, Recuperación de la fotoconversión de OCP1 de Synechocystis sp. PCC 6803 con FRPL existente como se indica a 20 °C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y SD de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos.

a, Alineación de la secuencia de aminoácidos de FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) con FRPL ancestrales y FRP ancestrales existentes y reconstruidos. Se señalan los sitios importantes para la homodimerización y la interacción con OCP1 en FRP7,8, y en rojo si están conservados o en azul si no. La numeración sigue SYNY3 FRP. Árboles ML para las reconstrucciones en la Fig. 1 + 2 complementaria. b + c, f + g, Distribución de probabilidades posteriores (pp) por sitio con 20 categorías bin por secuencia reconstruida con la media y el número de sitios ambiguos con pp > 0,2 para el estado con el segundo pp más alto mostrado. d + h, geles de poliacrilamida SDS al 15 % de proteínas ancestrales después de cromatografía de exclusión por tamaño. Las purificaciones se repitieron tres veces con resultados similares. conc., concentrado. e, Árbol filogenético de FRP (L) inicial sin raíz utilizado para la reconstrucción de ancestros alternativos (alt) en los nodos indicados. La longitud de las ramas representa sustituciones promedio por sitio. Árbol completo en la figura complementaria 2. HGT, transferencia genética horizontal. TBE, expectativa de transferencia de bootstrap. i + j, Recuperación de la fotoconversión de SYNY3 OCP1 con FRP ancestral alternativo (altFRPpostHGT) o FRPL ancestral alternativo (altFRPLpreHGT) como se indica en diferentes relaciones molares a 20 ° C con las respectivas constantes de tiempo de recuperación media (τ) y sd de tres réplicas independientes. Para mayor claridad, se muestran conjuntos de datos representativos. nd, no determinable.

a + b, Estimación de confianza por residuo (pLDDT) de los modelos AlphaFold2 que se muestran en la Fig. 4d + e. c, Confianza del AncOCPall de longitud completa predicho con los residuos indicados en el dominio C-terminal (CTD) involucrados en la interacción predicha con FRP de Synechocystis sp. PCC 6803 (SYNY3) que están bloqueados por la extensión N-terminal (NTE, en magenta) en el estado naranja compacto de AncOCPall predicho aquí. NTD, dominio N-terminal. d, Confianza de la interacción modelada entre AncOCPall y SYNY3 FRP. por ejemplo, errores alineados previstos (PAE). h + i, los modelos AlphaFold2 del CTD de OCPx de Gloeobacter kilaueensis JS1 no predicen una interacción con SYNY3 FRP en la interfaz esperada (consistente con los datos experimentales30), a menos que la serina (S) en la posición 264 (numeración SYNY3) se cambie por tirosina (Y ), el estado ancestral en AncOCPall que se muestra con más detalle aquí. Los insertos muestran PAE.

Higos suplementarios. 1–3, Tabla 1 y Discusión.

Subyacentes a múltiples alineamientos de secuencia de datos extendidos Figs. 1, 2 y 6 y Figs complementarias. 1 y 2.

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Reimpresiones y permisos

Steube, N., Moldenhauer, M., Weiland, P. et al. Las superficies de proteínas fortuitamente compatibles impulsaron el control alostérico en la fotoprotección de cianobacterias. Nat Ecol Evol 7, 756–767 (2023). https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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Recibido: 05 de septiembre de 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 03 de abril de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41559-023-02018-8

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